幽門螺桿菌UreI免疫特性及其治療性DNA疫苗的初步研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylri,Hp)是引起人急、慢胃炎、消化道潰瘍、胃癌和反流性食道炎的病原體，其與人冠心病、過敏性紫癜等疾病密切相關。Hp能在人胃酸性環(huán)境定植，主要是因該細菌有尿素酶和尿素膜通道蛋白(UreI)。Weeks等2001年研究指出Hp的ureI的基因是Hp在胃酸性環(huán)境定植和生存的關鍵基因，推測其為抗Hp感染的新藥物靶點，但目前沒有實驗證明。本研究用分子克隆方法獲得Hp的ureI基因和其原核表達載體，再誘導

2、得到重組UreI蛋白，并研究其免疫原性和免疫反應性。在ureI的5’端引入霍亂毒素B亞單位(CtB)基因，獲得CtB與UreI融合的重組蛋白和真核表達載體。用Hp感染的小鼠模型評價該真核載體作為治療性DNA疫苗的效果，探討Hp的ureI作為新藥靶點的可能性，同時尋找有希望的治療性疫苗。為達到此目的，本研究分五部分完成： 第一部分Hp尿素膜通道蛋白(UreI)的基因克隆、原核表達和免疫特性分析 首先克隆得到幽門螺桿菌尿素

3、膜通道的全長基因ureI,構建原核重組質(zhì)粒pET32a(+)-ureI和其原核表達工程菌株，并在特定的條件下用IPTG誘導工程菌表達了分子量分為43kD帶His標簽的重組蛋白rUreI，經(jīng)免疫印跡證明該重組蛋白的免疫反應性。 第二部分ctB與ureI雙基因融合的原核表達、蛋白純化和免疫特性分析 克隆了霍亂弧菌B亞單位基因(Cholera ToxinB,ctb)，并引入ureI基因的5’端，構建原核重組質(zhì)粒pET32a(+

4、)-ctB／ureI和其原核表達工程菌株，并在特定的條件下經(jīng)IPTG誘導工程菌表達了分子量為58kD帶His標簽的重組蛋白rCtB-UreI，用親和層析柱初步純化了ctB與ureI融合的重組蛋白rCtB-UreI，用免疫印記跡技術研究了重組蛋白的免疫反應性，再用此重組蛋白免疫小鼠后，在14、28、60天用間接ELISA檢測小鼠抗的抗體IgG水平，研究該重組蛋白的免疫原性。 第三部分urel和ctB／urel雙基因融合的真核質(zhì)粒構

5、建及其在真核細胞的表達定位分析 在以上研究的基礎上，構建了幽門螺桿菌尿素膜通道基因(ureI)以及霍亂弧菌B亞單位基因(ctB)與ureI融合的真核表達載體pIRES-RD2-ureI和plRES-RD2-ctB／ureI。經(jīng)雙酶切和測序鑒定正確后，相應質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK239T細胞和小鼠肌肉細胞，用免疫熒光和免疫組化等方法研究該兩種真核表達質(zhì)粒在傳代細胞和原代肌細胞中的轉(zhuǎn)染情況和目的蛋白的表達情況。實驗證明本研究獲得了ur

6、eI以及ctB和ureI 5’端融合的真核表達質(zhì)粒pIRES-RD2-ureI和pIRES-RD2-ctB／ureI，用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和小鼠肌肉原代細胞后，用熒光免疫和免疫組化方法初步表明了該兩種基因均能在真核細胞表達，細胞定位分析顯示表達的目的蛋白分布在真核細胞的細胞膜上。 第四部分幽門螺桿菌感染的小鼠模型建立 為了評價所構建的真核表達質(zhì)粒對Hp感染的防治效果，我們先用BALB／c、C57BL/6、KM(

7、昆明)三種SPF級小鼠感染幽門螺桿菌I型毒性菌株SSl，建立能在胃定植并引起高度胃組織病理損害的Hp感染小鼠模型。篩選出敏感的動物品系、適合的感染方法和評價指標，建立Hp感染的小鼠模型和綜合評價方法。以抗Hp的抗體IgG水平變化、Hp在胃組織的定植量和出血、壞死、炎癥和增生等病理損害指標綜合研究發(fā)現(xiàn)BALB／c小鼠和C57BL/6小鼠對Hp感染較敏感。 第五部分urel和ctB／urel質(zhì)粒DNA作為治療性疫苗的初步評價

8、 分別用該兩種真核表達質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒作DNA疫苗，200 μ g／只／次，分0、7、14天三次肌注免疫治療幽門螺桿菌感染的BALB／c小鼠，在免疫程序結束后第14天用免疫組化法研究DNA免疫后的抗原表達情況。用細菌分離培養(yǎng)法和快速尿素酶實驗研究Hp在胃的定植量。用間接ELISA方測定了外周血Hp抗體IgG水平的變化。夾心EIISA法定量測定外周血IFN-γ水平的變化。組織病理學檢查胃組織損害。從細胞免疫和體液免疫及組織病變等指標初步評

9、價DNA疫苗的治療效果。pIRES-RD2、plRES-RD2-ureI和plRES-RD2-ctB／ureI三種DNA質(zhì)粒肌注免疫Hp感染的小鼠模型后，從感染小鼠的臨床癥狀變化、Hp茵體定植量、病理損害臨床分值、抗Hp的抗體IgG水平變化和IFN-γ的水平變化等5方面綜合評價認為，與pIRES-RD2和PBS對照組比較，pIRES-RD2-ureI和pIRES-RD2-ctB／ureI在肌肉免疫39天后均對Hp的感染有一定的清除治療作

10、用，相對臨床評分值分別少22.2％和33.4％。在免疫69天后相對臨床評分值減少最多，分別達到72.1％和79.3％。同時與PBS組比較，plRES-RD2對照組在整個觀察期(14-69天)的相對臨床評分值減少僅為10％。 結論： 成功克隆到ureI基因并表達了重組UreI蛋白，初步證明了該蛋白有一定免疫反應性。成功構建并表達了CtB與UreI融合的重組蛋白rCtB-UreI，并證明了該蛋白有雙基因的免疫反應性和免疫原性

11、。成功構建的真核載體plRES2-DsRed2-ureI和plRES2-DsRed2-ctB／urel并證明其能在HEK298T細胞和肌肉細胞表達。成功建立了以BALB／c小鼠敏感動物，SSl為感染菌株的感染模型。用真核載體做DNA疫苗對Hp感染動物模型均有治療作用，分析表明urel基因是抗Hp的關鍵，是重要的疫苗靶點，同時ctB對ureI基因有佐劑作用。plRES2-DsRed2-tB／ureI組相對臨床評分值減少率最高，有望成為清除