黃連生物堿抗結(jié)腸癌作用實(shí)驗(yàn)及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察黃連總堿和小檗堿對(duì)結(jié)腸癌的防治作用，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法： 1．采用1-2 dimethylhydrazine(DMH)皮下注射(sc)+1％的dextransodium sulfate(DSS)水溶液飲用誘導(dǎo)形成大鼠結(jié)腸癌模型。實(shí)驗(yàn)分6組：(1)．模型組(DMH 40 mg/kg+DSS；(2)．美洛昔康小劑量組(DMH+DSS+0.45mg/kg)；(3)．美洛昔康大劑量組(DMH+DSS+1.3

2、5 mg/kg)：(4)．黃連總堿小劑量組(DMH+DSS+120 mg/kg)；(5)．黃連總堿大劑量組(DMH+DSS+360mg/kg)；(6)．小檗堿組(DMH+DSS+100mg/kg)。每組各25只大鼠。觀察各組藥物對(duì)誘瘤后第10 wk大鼠結(jié)腸ACF數(shù)量、第20 wk對(duì)大鼠結(jié)腸癌的發(fā)生率及體重變化的影響。應(yīng)用美藍(lán)染色法觀察ACF數(shù)量，HE染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和病理定性分析。 2．培養(yǎng)人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞，給予不同濃度

3、黃連總堿、小檗堿、美洛昔康和羅格列酮(10<'-6>mol/1、10<'-5>mol/l、10<'4>mol/l、10<'-3>mol/l)，作用細(xì)胞6 h、12h和24 h后，應(yīng)用四甲基谷氮藍(lán)實(shí)驗(yàn)(MTT)觀察對(duì)lovo細(xì)胞增殖的影響。 3．培養(yǎng)人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞，給予小檗堿(10<'-5>mol/l)+或不+GW9662(10<'-7> mol/l)和羅格列酮(10<'-5>mol/l)+或不+GW9662(10<'-7>

4、mol/l)分別作用24h后，應(yīng)用MTT法觀察對(duì)lovo細(xì)胞增殖的影響。 4．采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription ploymerse chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)各用藥組細(xì)胞COX-2、PPARTmRNA表達(dá)水平。 5．采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)各用藥組細(xì)胞COX-2、PPARγ蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1．黃連生物堿對(duì)DMH+D

5、SS處理大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響黃連生物堿可以明顯改善DMH+DSS誘癌過(guò)程中大鼠的惡液質(zhì)狀態(tài)，阻斷體重減輕。 2．黃連生物堿對(duì)DMH+DSS誘導(dǎo)大鼠ACF的影響實(shí)驗(yàn)第10 wk，模型組大鼠誘導(dǎo)出ACF19.2±3.5，數(shù)量明顯高于各藥物干預(yù)組。黃連總堿大、小劑量組對(duì)ACF的形成呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制(P<0.05)；與黃連總堿小劑量相當(dāng)?shù)男￠迚A組ACF平均數(shù)量明顯低于模型組(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照美洛昔康大、小劑量組對(duì)ACF的形成也

6、呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制(P<0.05)；黃連大劑量組、美洛昔康大劑量組和小檗堿組組間比較ACF形成數(shù)量沒(méi)有明顯差異。 3．黃連生物堿對(duì)DMH+DSS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸癌的影響實(shí)驗(yàn)第20wk，模型組結(jié)腸癌發(fā)生率為80％，明顯高于各藥物干預(yù)組(P<0.01)；黃連總堿大小劑量組的誘癌率分別為33.3％、25％；與黃連總堿小劑量組相當(dāng)?shù)男￠迚A組誘癌率與其相同為33.3％；陽(yáng)性對(duì)照美洛昔康大小劑量組的誘癌率分別為40％、26.7％。組間比較無(wú)明

7、顯差異。 4．黃連生物堿對(duì)lovo細(xì)胞增殖的抑制作用及其與PPARγ、COX-2的關(guān)系黃連總堿、小檗堿在濃度大于10<'-5>mol/l，陽(yáng)性對(duì)照藥物羅格列酮在濃度大于10<'-5>mol/l、美洛昔康在濃度大于10<'-4>mol/l明顯抑制lovo細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，且呈濃度和時(shí)間依賴性。黃連總堿、小檗堿、美洛昔康和羅格列酮對(duì)lovo細(xì)胞作用24 h IC<,50>分別為3.21±0.1μmol/l、2.83±0.2μmol

8、/l、4.99±0.17μmol/l和3.14±0.135μmol/l。 PPARγ特異性阻斷劑GW9662預(yù)處理細(xì)胞后，羅格列酮對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯減弱(P<0.01)，但是對(duì)小檗堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用沒(méi)有影響。小檗堿和羅格列酮能濃度依賴性地降低lovo細(xì)胞中COX-2和PPARTmNRA表達(dá)，對(duì)COX-2蛋白表達(dá)也呈濃度依賴性抑制，但是對(duì)PPAγ蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著影響。PPARγ特異性阻斷劑GW9662預(yù)處理細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)了羅格列

9、酮對(duì)COX-2 mRNA和蛋白的抑制表達(dá)作用。 結(jié)論： 1．黃連生物堿能抑制大鼠誘癌早期ACF的形成和腫瘤發(fā)生率。對(duì)DMH+DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌有明顯的化學(xué)預(yù)防作用。 2．黃連生物堿能抑制人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。與小檗堿和陽(yáng)性藥物比較黃連總堿作用最為明顯，這可能與黃連總堿中含有其他生物堿有關(guān)。 3．PPARγ特異性阻斷劑GW9662不能逆轉(zhuǎn)小檗堿誘導(dǎo)lovo細(xì)胞凋亡的作用，提示小檗堿的抗腫瘤