褪黑素及其合成限速酶在腎藏象調(diào)控理論中作用和地位的探討與研究.pdf

1、中醫(yī)藏象理論是中醫(yī)學(xué)理論體系的核心組成部分，天人相應(yīng)是中醫(yī)認(rèn)識人體的重要特征之一。在“天人相應(yīng)”理論直接指導(dǎo)下，所形成的對人體臟腑生理的認(rèn)識，不同于近代西方醫(yī)學(xué)還原論思想指導(dǎo)下的生物醫(yī)學(xué)模式。它突出了人體的整體協(xié)調(diào)控制，形成了五臟應(yīng)時模式。從時間結(jié)構(gòu)的角度認(rèn)識人體是中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)從空間結(jié)構(gòu)認(rèn)識人體的最主要區(qū)別所在，是中醫(yī)基本理論概念如藏象、經(jīng)絡(luò)的本質(zhì)特征所在。因此，從天人相應(yīng)的角度出發(fā)，“以臟應(yīng)時”已經(jīng)成為藏象本質(zhì)研究的重要途徑。

2、 1．目的 從天人理論出發(fā)，以“褪黑素”為切入點，通過探討腎藏象調(diào)控理論與褪黑素季節(jié)性變化內(nèi)在調(diào)節(jié)機制的相關(guān)性，從時間結(jié)構(gòu)角度，部分揭示中醫(yī)腎藏象本質(zhì)內(nèi)涵；同時引入四季模擬系統(tǒng)，人工模擬自然季節(jié)變化，為中醫(yī)藏象學(xué)說和“天人相應(yīng)”理論的研究提供新的途徑，為中醫(yī)基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代研究提供新的思路和方法。 2．方法 2．1理論研究：采用文獻學(xué)、邏輯分析等方法，對采用人工模擬系統(tǒng)進行“天人相應(yīng)”理論研究的必要性、重要性進行

3、了探討。并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)(NEI)的先進研究成果，對以“褪黑素”為切入點進行藏象本質(zhì)研究的思路進行了可行性和可信性分析，提出了從褪黑素季節(jié)性變化的內(nèi)在調(diào)節(jié)機制進行中醫(yī)藏象時間結(jié)構(gòu)本質(zhì)研究的方法和途徑。 2．2實驗研究 2．2．1研究思路：以褪黑素為切入點，觀察在生理狀態(tài)下，大鼠血清褪黑素(MT)、松果腺中褪黑素合成限速酶AANAT、HIOMT活性、AANAT蛋白質(zhì)水平及mRNA表達的冬夏變化規(guī)律，并分析其

4、相關(guān)性。另外，結(jié)合四季模擬系統(tǒng)進行反季節(jié)模擬，對上述指標(biāo)進行觀察，與自然季節(jié)下的狀態(tài)進行比較。 2．2．2實驗對象：健康SD大鼠，雄性，180一200g/只。在冬至日、夏至日前一個月購入大鼠，按隨機數(shù)字表法，隨機分為自然季節(jié)組和模擬季節(jié)組。自然季節(jié)組：大鼠飼養(yǎng)于采光充足、室溫可控的動物房，自然光照(不加人工照明)；室溫：冬季(17±2)℃，夏季(25±2)℃。濕度自然。模擬季節(jié)組：采用四季模擬系統(tǒng)箱。四季模擬箱中的模擬季節(jié)與時令

5、季節(jié)相反(冬季時模擬夏季；夏季時模擬冬季)。模擬的季節(jié)氣候因素主要包括光照、溫度、濕度。其中主要以晝夜長短的變化作為季節(jié)變化的重要參變量。以上動物均可自由攝取水及飼料。飼料為普通鼠全價顆粒飼料。飼養(yǎng)至冬至日(12.22)和夏至日(6.21)晚9時斷頭處死。 2．2．3指標(biāo)測定血清褪黑素，I<'125>標(biāo)記放射免疫法；松果腺中褪黑素合成限速酶AANAT、HIOMT活性，同位素標(biāo)記的酶活性測定法；限速酶．AANAT蛋白質(zhì)水平測定，w

6、estern blot法：限速酶AANAT mRNA表達，熒光實時定量PCR(Real-time PCR)法。 2．2．4統(tǒng)計分析方法：所有數(shù)據(jù)以x±S表示，組間差異利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行ANOVA檢驗，以P<0.05差異為有顯著性。變量關(guān)系采用直線相關(guān)分析。 3．結(jié)果 3．1在自然條件下，冬夏季節(jié)大鼠血清褪黑素含量、褪黑素合成限速酶mANAT活性、蛋白質(zhì)水平、mRNA表達均呈現(xiàn)出冬高夏低的分布趨勢，

7、變化非常明顯，差異有顯著性，p<0.05。褪黑素合成限速酶HIOMT活性有冬高夏低趨勢，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 3．2在四季模擬系統(tǒng)條件下，模擬冬季組褪黑素含量、AANAT酶活性高于模擬夏季組，且有顯著性差異(p<0.05)，與自然條件下冬夏節(jié)律一致；模擬冬季組與自然冬季組相比，模擬夏季組與自然夏季組相比均無顯著性差異(P>0.05)，提示應(yīng)用四季模擬系統(tǒng)模擬自然季節(jié)較為成功，利用其模擬季節(jié)進行科學(xué)研究的思路具有

8、可行性。 3．3通過SPSS13.0統(tǒng)計軟件相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠血清褪黑素與松果腺中褪黑素合成限速酶AANAT活性、蛋白質(zhì)水平和mRNA表達均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.950，0.722和0.659，(p<0.01)；模擬系統(tǒng)下上述指標(biāo)依然為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.785，0.713，0.740，(p<0.01)。 4．結(jié)論 4．1基于“天人相應(yīng)”理論的腎藏象調(diào)控機制與褪黑素及其合成限速酶AANAT的季節(jié)性變

9、化關(guān)系密切，褪黑素可能是腎藏象調(diào)控機制的控制器。 本次實驗通過對血清褪黑素、褪黑素合成限速酶AANAT的酶活性、蛋白質(zhì)水平及mRNA的表達的冬夏變化規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，上述各項指標(biāo)在冬季時功能加強，且均為正相關(guān)。結(jié)合中醫(yī)學(xué)“五臟應(yīng)時”理論及前期研究成果可以推斷：機體在受到相應(yīng)環(huán)境信息(如光照等)的刺激后，首先激活了松果腺細(xì)胞內(nèi)褪黑素合成限速酶AANAT的功能，主要表現(xiàn)在酶活性的改變，從而使合成的褪黑素呈現(xiàn)季節(jié)性變化，松果腺通過MT分泌

10、的改變將環(huán)境光照周期的信號傳給下丘腦一神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)一體內(nèi)有關(guān)的組織和器官，使得它們的功能活動適應(yīng)外界的變化，從而形成了一系列與季節(jié)相應(yīng)的有規(guī)律的綜合生理效應(yīng)。這些生理效應(yīng)符合中醫(yī)“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也……通于冬氣”的論述。 4．2從天人相應(yīng)理論出發(fā)，從時間結(jié)構(gòu)角度探討藏象本質(zhì)，是認(rèn)識機體復(fù)雜整體調(diào)節(jié)狀態(tài)的一個很好途徑。 通過本次研究結(jié)合前期研究成果得出：季節(jié)對機體的影響不是單一點的作用，而是涉及到了體內(nèi)信

11、息調(diào)節(jié)機制的各個層次，中醫(yī)腎藏象的時間結(jié)構(gòu)本質(zhì)具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)。在一定程度上表明了從天人相應(yīng)理論出發(fā)，從時間結(jié)構(gòu)角度探討藏象本質(zhì)，是認(rèn)識機體復(fù)雜整體調(diào)節(jié)狀態(tài)的一個很好途徑。 4．3四季模擬系統(tǒng)可以較為成功的模擬自然界氣候的大致變化，借助該系統(tǒng)進行“天人相應(yīng)”理論的相關(guān)研究具有可行性及可信性。 通過實驗證明，在四季模擬系統(tǒng)條件下，血清褪黑素、褪黑素合成限速酶AANAT的酶活性、蛋白質(zhì)水平及mRNA的表達的冬夏節(jié)律與自然條