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1、OVA66是本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用SEREX(SEREX)方法從人卵巢癌cDNA文庫篩選得到的一個(gè)新的卵巢癌相關(guān)基因。該基因含有1752bp的開放讀碼框,編碼583個(gè)氨基酸。前期研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞株中,OVA66基因不僅表達(dá)增高,而且發(fā)生突變。采用組織芯片結(jié)合免疫組化法檢測(cè)118個(gè)組織中OVA66的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性和惡性高的腫瘤組織中,OVA66表達(dá)量更高,提示OVA66可能與腫瘤的惡性程度以及轉(zhuǎn)移性有關(guān);經(jīng)對(duì)48例正常人和113例腫
2、瘤病人的血清分析發(fā)現(xiàn),腫瘤患者體內(nèi)的OVA66抗體水平顯著高于正常人;近期研究還發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾HeLa細(xì)胞中OVA66蛋白的表達(dá)能顯著抑制該細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡,并且下調(diào)HeLa細(xì)胞內(nèi)VEGF、Mdm2和ITGA2等基因表達(dá)。本文對(duì)腫瘤抗原OVA66生物學(xué)特性及相互作用蛋白進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容如下: ⑴腫瘤抗原基因OVA66生物信息學(xué)分析。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)OVA66基因及其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了一系列的分析。結(jié)果表明OVA66基因含有
3、10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子,跨度93.37kb,編碼蛋白含有一個(gè)p23-NUDCD1保守結(jié)構(gòu)域。蛋白同源性分析發(fā)現(xiàn)除了與人慢性粒細(xì)胞白血病抗原CML66高度同源外,OVA66在小鼠、犬、線蟲和果蠅中都有高度同源性的序列存在。多種蛋白亞細(xì)胞定位在線軟件分析表明,OVA66主要表分布在細(xì)胞質(zhì)。電子Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)OVA66幾乎表達(dá)于所有腫瘤類型。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫查找OVA66的相互作用蛋白信息,發(fā)現(xiàn)OVA66可能與MMP15
4、、UPAR、S100A4、BOC、TMEM37和EXOSC5等存在相互作用。 ⑵OVA66蛋白亞細(xì)胞分布定位。利用本室制備的OVA66單克隆抗體,免疫組化法檢測(cè)人6類不同惡性腫瘤組織OVA66蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示特異性棕色反應(yīng)主要出現(xiàn)在惡性腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)。通過間接免疫熒光法,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性O(shè)VA66蛋白在腫瘤細(xì)胞HeLa、SW480和正常細(xì)胞COS7、HEK293都有一定量表達(dá),主要分布在胞質(zhì)內(nèi)。利用增強(qiáng)型熒光報(bào)告蛋白EGFP和小
5、分子標(biāo)簽Flag顯示OVA66融合蛋白在COS7和HEK293細(xì)胞的表達(dá),發(fā)現(xiàn)外源性EGFP-OVA66和Flag-OVA66融合蛋白也主要呈胞質(zhì)分布。Western blot檢測(cè)HeLa細(xì)胞各組份OVA66蛋白的表達(dá)情況支持上述結(jié)論。通過分子探針結(jié)合特異性O(shè)VA66單抗,發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞內(nèi)OVA66蛋白分別與高爾基體和線粒體存在部分共定位。 ⑶高表達(dá)OVA66基因?qū)φ<?xì)胞生物學(xué)功能的影響。將重組真核表達(dá)載體pFlag-OV
6、A66轉(zhuǎn)染子OVA66基因低表達(dá)的小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3,經(jīng)G418篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)株。經(jīng)Real-timePCR、Western Blot和FACS分析表明,轉(zhuǎn)基因NIH3T3細(xì)胞OVA66 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高。應(yīng)用MTT顯色法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長(zhǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線,證實(shí)轉(zhuǎn)染OVA66基因可以促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)也證實(shí),轉(zhuǎn)基因NIH3T3細(xì)胞的增殖能力與對(duì)照細(xì)胞相比明顯增強(qiáng)。而且轉(zhuǎn)基因細(xì)胞周期發(fā)生明
7、顯變化,與對(duì)照細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)基因NIH3T3細(xì)胞S期細(xì)胞比率增高8.65%(12.40%到21.05%),G1/G0期細(xì)胞比率顯著降低11.53%(80.32%到68.79%),G2/M期細(xì)胞略有升高2.88%(7.28%到10.16%)。表明OVA66可以使大量細(xì)胞進(jìn)入合成期促進(jìn)細(xì)胞增殖。體外遷徙運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),OVA66基因可以促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞的遷徙運(yùn)動(dòng)能力,與對(duì)照細(xì)胞相比二者有顯著性差異(P<0.01)。FACS分析顯示高表達(dá)OV
8、A66的NIH3T3細(xì)胞能夠部分抑制5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 ⑷相互作用蛋白的篩選與驗(yàn)證。構(gòu)建pGB-OVA66酵母表達(dá)載體,以O(shè)VA66蛋白為“誘餌蛋白”,篩選HeLa細(xì)胞cDNA文庫,尋找OVA66相互作用蛋白。共獲得11個(gè)與OVA66誘餌蛋白相互作用的陽性克隆,其中9個(gè)克隆經(jīng)測(cè)序證實(shí)均為衣被蛋白復(fù)合體β亞基(Coatomer protein complex,subunitβ1,COPB1),并且其中8個(gè)克隆編碼蛋白序列位于
9、COPB1蛋白羧基端。其余兩個(gè)陽性克隆分別為ATP依賴性RNA解旋酶DHX38(ATP-dependent RNAhelicase DEAD/H box polypeptide38)和DDX3X(ATP-dependent RNAhelicase DEAD box polypeptide3,X-Iinked)o分別構(gòu)建帶有Flag和Myc蛋白表位標(biāo)簽的OVA66和COPB1-C片段(COPB1羧基端270aa)真核表達(dá)質(zhì)粒,兩種重組質(zhì)粒
10、共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,通過瓊脂糖微珠EZviewTM Red Protein G Affinity Gel和anti-myc抗體進(jìn)行免疫復(fù)合物共沉淀,以anti-flag抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè),確定OVA66和COPB1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)是否存在相互作用。結(jié)果顯示anti-myc抗體沉淀COPB1-C-myc蛋白同時(shí),OVA66-flag蛋白也一同被沉淀。運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記方法對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)COPB1和OVA66蛋白進(jìn)
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