龍眼胚胎乙醇脫氫酶的分離純化、鑒定及其cDNA克隆.pdf

1、在龍眼離體胚胎發(fā)生中發(fā)現(xiàn)存在某種類型的脫氫酶，初步的研究顯示該組蛋白質(zhì)可能是NAD依賴型的類糖醇脫氫酶。比較了該類糖醇脫氫酶在龍眼離體胚胎發(fā)生過程中的變化，發(fā)現(xiàn)隨著胚發(fā)育進(jìn)程，其活性逐步降低;同工酶電泳顯示，雖然其酶譜各譜帶均出現(xiàn)于胚性愈傷組織、球形胚和子葉胚中，但隨著胚的發(fā)育其染色強(qiáng)度不斷降低，顯示龍眼離體培養(yǎng)材料存在的該組酶與其離體胚的發(fā)生、發(fā)育有關(guān)。為了明確該組類糖醇脫氫酶的屬性，以揭示其在龍眼胚胎發(fā)生、發(fā)育過程中的生理作用，本試

2、驗(yàn)進(jìn)行了該酶的分離、純化、生物質(zhì)譜鑒定及其cDNA克隆。主要研究結(jié)果如下： 1.龍眼胚性愈傷組織類糖醇脫氫酶的分離純化。采用低濃度的DTT以及加入10％的甘油有利于該組類糖醇脫氫酶在體外溶液環(huán)境的穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上，通過研究其在不同層析分離介質(zhì)中的分離特性，建立了適用于該組類糖醇脫氫酶的分離純化體系。經(jīng)過80％飽和度的(NH4)2SO4鹽析、SephadexG-25柱脫鹽，然后經(jīng)過DEAE-SepharoseF.F.、DEAE-5

3、2、PhenylSepharose和Superdex200柱層析，從龍眼胚性愈傷組織中分離純化得到類糖醇脫氫酶的2個(gè)同工酶組分Lc.A和Lc.B。比較非變性PAGE和SDS-PAGE的結(jié)果，顯示Lc.A和Lc.B均為同型二體蛋白，其亞基的表觀分子量大小相同，為47.4kD。Lc.A和Lc.B具不同的等電點(diǎn)。 2.龍眼胚性愈傷組織類糖醇脫氫酶的生物質(zhì)譜鑒定。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)進(jìn)行肽質(zhì)量

4、指紋分析，顯示Lc.A和Lc.B均能較好地與其他植物的乙醇脫氫酶(ADH)相匹配。應(yīng)用電噴霧解離—四極桿—飛行時(shí)間串連質(zhì)譜(ESI-Q-TOF2)技術(shù)解析了Lc.B的4個(gè)胰酶水解肽段的氨基酸序列，分別是：GTFFGNYKPR、KFGVTEFVNPK、AFEYMLGGDGR和FITHEVPFSEINK；解析了Lc.A的4個(gè)胰酶水解肽段的氨基酸序列，分別是：FGVTEFVNPK、GTFFGNYKPR、FITHEVPFSEINK和DYDKPV

5、QEVIAEMTDGGVDR(或者DYDKPVKEVLAEMTDNVDR)。數(shù)據(jù)庫檢索和序列比對(duì)分析均表明Lc.A和Lc.B均顯著匹配于ADH。因此，在肽質(zhì)量指紋的基礎(chǔ)上，鑒定從龍眼胚性愈傷組織中純化得到的類糖醇脫氫酶Lc.A和Lc.B分別為ADH同工酶的2個(gè)組分。 3.龍眼離體胚胎發(fā)生、發(fā)育過程中ADH的活性變化測(cè)定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從胚性愈傷組織至球形胚和子葉胚階段，ADH的活性呈下降趨勢(shì)，同工酶譜分析進(jìn)一步顯示了相同的結(jié)果，表明

6、高ADH活性可能與龍眼的體胚早期發(fā)生或與維持愈傷組織的高再生能力有關(guān)。 4.龍眼胚性愈傷組織ADHcDNA克隆。采用同源克隆的方法獲得了龍眼ADHcDNA的保守片段，并在此基礎(chǔ)上，通過3'和5'-RACE，獲得了龍眼ADH的cDNA全序列，該序列與其他植物ADHcDNA有很高的同源性。該cDNA全長(zhǎng)1386bp，包含一個(gè)1140bp的開放閱讀框，編碼380個(gè)氨基酸。在推導(dǎo)的氨基酸序列中，發(fā)現(xiàn)其存在乙醇脫氫酶酶活性催化中心的鋅(Z

7、n)結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)性Zn結(jié)合位點(diǎn)。分析其閱讀框架發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)質(zhì)譜獲得的Lc.A和Lc.B的肽片段序列均分別包含在其推導(dǎo)的氨基酸序列中，從而認(rèn)為龍眼中的乙醇脫氫酶Lc.A和Lc.B可能為該cDNA的編碼產(chǎn)物；將該cDNA的開放閱讀框克隆到表達(dá)載體pET-15b中，并在大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中獲得了融合表達(dá)。 5.龍眼合子胚ADHcDNA的克隆。從龍眼合子胚幼胚中提取得到總RNA，采用RT-PCR的方法，克隆得到ADHcD