新生SD大鼠實驗性缺氧缺血腦組織內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖及BRCA1基因的調(diào)控作用研究.pdf

1、第一部分新生鼠缺氧缺血性腦損傷動物模型的建立和內(nèi)源性神經(jīng)干細胞表達變化的時空性研究 目的：建立新生鼠缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemie brain damage，HIBD)動物模型。研究內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)在新生鼠生理狀態(tài)下表達的時空性變化和缺氧缺血性腦損傷時的激活增殖情況。 方法：采用SPF級，11—15克體重的7日齡新生SD大鼠做研究對象。實驗動物隨機分為H

2、IBD組和假手術(shù)對照組，每組8只。取HIBD后12h,1d,3d,7d和14d為觀察點。經(jīng)雙線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈及8％氧氣的低氧處理2h，建立缺氧缺血性腦損傷動物模型，光鏡和電鏡做病理學(xué)檢驗觀察病變。用免疫熒光法檢測對照組和HIBD后巢蛋白(nestin)的表達變化。 結(jié)果：①HIBD后12—24h，神經(jīng)元細胞出現(xiàn)腫脹變性；HIBD后3d，細胞排列更加紊亂，出現(xiàn)核固縮、細胞濃染。HIBD后1d電鏡下細胞突觸減少，線粒體腫脹。②.對

3、照組在熒光顯微鏡下見到側(cè)腦室和海馬區(qū)出現(xiàn)胞漿綠色熒光，為異硫氰酸熒光素(F1uorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的nestin。側(cè)腦室區(qū)nestin熒光強度之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。海馬區(qū)nestin熒光強度之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。各時間點側(cè)腦室和海馬區(qū)熒光強度比較，側(cè)腦室區(qū)高于海馬區(qū)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。③．HIBD后與對照組比較，nestin熒光

4、強度1d開始升高，3d明顯升高，7d、14d逐漸下降，P均<0.05。HIBD后各時間點側(cè)腦室和海馬區(qū)nestin熒光強度比較，P均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：①將7日齡SD大鼠經(jīng)單側(cè)頸總動脈結(jié)扎及8％低氧處理，可以成功建立HIBD模型。②生理狀態(tài)下，腦組織有神經(jīng)干細胞存在，以側(cè)腦室和海馬區(qū)為主，側(cè)腦室神經(jīng)干細胞相對集中；神經(jīng)干細胞處于穩(wěn)定表達狀態(tài)。③HIBD可激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞表達，損傷后3d明顯。 第二部

5、分新生鼠實驗性缺氧缺血腦組織BRCAlmRNA和BRCAl蛋白表達及意義 目的：觀察乳腺癌易感基因(breast cancer suscepfibility gene，BRCAl)mRNA和BRCAl蛋白在HIBD后腦組織中的表達變化，探討其意義。 方法：采用實時熒光定量PCR法檢測BRCAlmRNA在對照組和HIBD后腦組織中的表達；采用免疫印跡法(Westem Blot)檢測BRCAl蛋白在對照組和HIBD后腦組織中

6、的表達。 結(jié)果：①HIBD新生鼠腦中BRCAlmRNA表達與對照組相比，12h開始升高，1d明顯升高，3d、7d逐漸下降，P均<0.05。②BRCAl蛋白表達與對照組比較，在HIBD后12h-24h開始升高，3d明顯升高，7d逐漸下降，P均<0.05。 結(jié)論：①HIBD新生SD大鼠腦組織中BRCAlmRNA和BRCAl蛋白均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。②新生SD大鼠腦組織在生理和HIBD后，均有神經(jīng)干細胞和BRCAl基因和蛋

7、白的表達，損傷后表達增高。三者變化趨勢一致。 第三部分雌激素干預(yù)BRCAl基因表達對新生SD大鼠實驗性缺氧缺血神經(jīng)干細胞增殖影響的研究 目的：觀察雌激素(17 β-estradiol，17β-E2)干預(yù)BRCAlmRNA表達后，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的變化情況，初步探討B(tài)RCAl基因與神經(jīng)干細胞增殖的關(guān)系。 方法：取HIBD后3d為觀察點。新生鼠分為6組：假手術(shù)對照組、單純HIBD組、使用橄欖油的空白對照組、使用低

8、濃度E2組、使用中濃度E2組、使用高濃度E2組。雌激素干預(yù)組每天給予頸部皮下注射雌激素一次，共3d。用實時熒光定量PCR法檢測BRCAl mRNA表達。5-溴脫氧尿苷嘧啶(bromodeoxyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶脫氧核酸類似物，可在有絲分裂的S期摻入DNA的合成，故常用Brdu陽性來檢測細胞的增殖。為同時檢測神經(jīng)干細胞的增殖變化情況，給試驗動物腹腔注射Brdu(50mg／kg，每天2次，共3天)，用免疫熒光法檢測海馬區(qū)B

9、rdu陽性細胞數(shù)了解海馬區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖變化。對BRCAlmRNA與神經(jīng)干細胞增殖之間的關(guān)系做相關(guān)性分析。 結(jié)果：①隨著使用雌激素濃度升高，BRCAl mRNA表達升高，使用高濃度E2組BRCAl mRNA表達最高。各組間比較P均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②海馬區(qū)熒光素羅丹明(Rhodamine)標記的呈紅色熒光的Brdu陽性細胞數(shù)在使用雌激素后增多，以使用高濃度E2組明顯。各組間比較P均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。⑧經(jīng)