黃芪、莪術(shù)配伍的增效作用及通過PPARγ-NF-κB信號(hào)途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：1.以寨來昔布和羅格列酮作為對照，通過體外研究觀察黃芪、莪術(shù)及黃芪與莪術(shù)配伍對MKN-45細(xì)胞生長、AKP、LDH及VEGF表達(dá)的抑制情況，檢測黃芪與莪術(shù)配伍后是否具有增效作用，并觀察各組藥物對MKN-45細(xì)胞COX-2、NF-κB、PPARγ表達(dá)的影響，探討中藥調(diào)控COX-2表達(dá)的作用機(jī)制。2.仍以塞來昔布和羅格列酮作為對照，采用組織塊移植法在BALB/c裸鼠體內(nèi)建立原位移植人胃癌模型，觀測黃芪、莪術(shù)及黃芪與莪術(shù)配伍對人胃癌細(xì)胞

2、在BALB/c裸鼠體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移的影響，分析黃芪與莪術(shù)配伍后是否具有協(xié)同增效作用，并檢測各組藥物對人胃癌細(xì)胞COX-2、NF-κB、PPARγ表達(dá)的影響，從體內(nèi)研究進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪與莪術(shù)配伍調(diào)控通過PPARγ/NF-κB實(shí)現(xiàn)對COX-2表達(dá)的調(diào)控。 方法：體外研究：體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞MKN-45，取對數(shù)生長期細(xì)胞分塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術(shù)組、黃芪與莪術(shù)配伍組和空白組，藥物濃度分別為100umol/L、20umol/L、

3、10mg/L、5mg/L、10mg/L，分別在作用24h、48h、72h后收集細(xì)胞。用MTT法檢測對細(xì)胞的生長抑制率，用分光光度法檢測對細(xì)胞內(nèi)LDH、AKP的影響，用ELISA法檢測對VEGF表達(dá)的抑制情況。應(yīng)用RT-PCR法檢測各實(shí)驗(yàn)組COX-2mRNA、NF-κBmRNA、PPARγmRNA表達(dá)的變化，western blot方法檢測各組細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的變化。體內(nèi)研究：體外培養(yǎng)人胃痛細(xì)胞MKN-45，采用組織塊移植法在BAL

4、B/c裸鼠體內(nèi)建立原位移植人胃癌模型，60只裸鼠隨機(jī)分為6組：塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術(shù)組、黃芪與莪術(shù)配伍組和空白組，于造模后第三天開始灌胃給藥（0.2ml/10g），其中塞來昔布組：90P g·Ng-1·G·1，羅格列酮組：1.8P g·Ng-1·G·1，黃芪組：6.75g·Ng-1·-G·1，莪術(shù)組：4.5g·Ng-1·G·1，黃芪、莪術(shù)配伍組：11.25 g·Ng·-1·G·1，空白組給予同體積生理鹽水。分別于給藥的第3

5、周和第6周處死裸鼠，用電子天平檢測各組荷瘤裸鼠的體重和瘤塊的重量，比較各組藥物對荷瘤裸鼠體重的影響，計(jì)算各組藥物對瘤塊生長的抑制率，并點(diǎn)算第6周各組實(shí)驗(yàn)裸鼠的肝轉(zhuǎn)移病灶的情況，用免疫組化法檢測瘤塊微血管密度（MVD）的變化，計(jì)算各組藥物的對瘤塊微血管密度（MVD）的抑制率。應(yīng)用RT-PCR法檢測兩個(gè)時(shí)間段各實(shí)驗(yàn)組COX-2mRNA、NF-κBmRNA、PPARγmRNA表達(dá)的變化，以western blot方法檢測各組瘤塊COX-2蛋白

6、表達(dá)的變化。 結(jié)果：體外研究：各組藥物均能顯著抑制細(xì)胞生長，并具有時(shí)間依賴性，其中以塞來昔布組的抑制作用最強(qiáng)，配伍組作用其次，并明顯強(qiáng)于單位中藥組。塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術(shù)組、黃芪與莪術(shù)配伍組在不同時(shí)間的抑制率分別為：24h：11.28％、3.91％、8.27％、8.86％、10.04％；48h：28.07％、15.11％、17.08％、24.57％、26.39％；72h：45.78％、24.9％、28.34％、32

7、.07％、39.68％。各組藥物對細(xì)胞分化酶的抑制作用起始于48h，至72h時(shí)作用最強(qiáng)，以塞來昔布組和配伍組作用最明顯。各組藥物對VEGF均有顯著抑制作用，總體以塞來昔布組和配伍組作用最強(qiáng)，明顯優(yōu)于其余3組（P<0.05）。各組藥物隨著作用時(shí)間的延長，對COX-2mRNA、NF-κBmRNA的表達(dá)均有不同程度的下調(diào)作用，以塞來昔布組和配伍組最明顯，莪術(shù)組與羅格列酮組接近，除莪術(shù)外，各組藥物均能促進(jìn)PPARγmRNA的表達(dá)，以羅格列酮組和

8、配伍組作用最明顯，COX-2蛋白表達(dá)的變化與COX-2mRNA基本吻合。體內(nèi)研究：所有藥物中僅黃芪與莪術(shù)配伍組在作用6周時(shí)的裸鼠體重高于其余各組體重（P<0.01），其余4組藥物組和空白組體重?zé)o明顯差異。對瘤塊生長的影響，作用3周時(shí)各組藥物均有顯著的抑瘤作用，與空白組相比，除羅格列酮組P<0.05外，其余各組藥物均P<0.01，此時(shí)塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術(shù)組、黃芪與莪術(shù)配伍組抑瘤率分別為：25.27％、10.45％、13.0

9、0％、13.72％、27.44％。作用6周時(shí)各組藥物與空白組相比均P<0.01，此時(shí)塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術(shù)組、黃芪與莪術(shù)配伍組抑瘤率分別為：37.73％、20.45％、33.64％、26.40％、43.12％。對瘤塊MVD的抑制作用，作用3周時(shí)，與空白組相比，塞來昔布組、莪術(shù)組和配伍組P<0.01，羅格列酮組和黃芪組P<0.05，此時(shí)對MVD的抑制率分別為：41.94％、12.90％、12.90％、25.81％、38.71

10、％。作用6周時(shí)各組藥物對MVD的抑制作用與空白組相比均P<0.01，此時(shí)對MVD的抑制率分別為：43.75％、18.75％、27.08％、21.88％、50.00％。對肝轉(zhuǎn)移的影響，實(shí)驗(yàn)第3周未見明顯的肝臟轉(zhuǎn)移灶，第6周時(shí)，給藥組轉(zhuǎn)移灶均顯著少于空白組，配伍組作用最明顯，優(yōu)于其余任意一組，其余幾組組間無顯著差異。對RT-PCR凝膠電泳產(chǎn)物和蛋白條帶進(jìn)行灰度分析顯示，對COX-2表達(dá)的影響中，塞來昔布組與配伍組能具有顯著抑制作用（與空白組

11、相比P<0.01），且配伍組作用至6周時(shí)顯著優(yōu)于塞來昔布組（P<0.05），羅格列酮組作用3周時(shí)降低不明顯，但至6周時(shí)可以顯著抑制COX-2（P<0.01）。對PPARγ表達(dá)的影響中，作用3周時(shí)羅格列酮組促表達(dá)作用顯著（P<0.01），配伍組P<0.05，作用至6周時(shí)，羅格列酮組和配伍組與空白組相比均為P<0.01和P<0.01，此時(shí)塞來昔布組亦產(chǎn)生促表達(dá)作用（P<0.05）。對NF-κB表達(dá)的影響中，作用3周時(shí)羅格列酮組和配伍組具有明

12、顯抑制作用（P<0.05），作用至6周時(shí)，與空白組相比羅格列酮組和配伍組P<0.01，塞來昔布組、黃芪組、莪術(shù)組均P<0.05。 結(jié)論：1.黃芪與莪術(shù)配伍后對腫瘤細(xì)胞生長的抑制具有增效作用。2.COX-2是益氣活血治法的有效作用靶點(diǎn)之一，黃芪與莪術(shù)配伍后對COX-2的抑制具有增效作用。3.黃芪與莪術(shù)的配伍可能是部分通過PPARγ/NF-κB信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)對COX-2表達(dá)的調(diào)控。4.黃芪與莪術(shù)的配伍能更有效的改善荷瘤機(jī)體的生存質(zhì)量、