肝細胞生長因子對神經元缺氧-復氧損傷的影響及其分子機制研究.pdf

1、目的：研究肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)對大腦皮層神經元缺氧/復氧損傷的影響，并探討其可能的分子機制。 方法：取原代培養(yǎng)的Sprague-Dawley大鼠大腦皮層神經元細胞，以LDH漏出率作為細胞損傷指標、MTT比色法檢測細胞活力、流式細胞術分析細胞凋亡率，研究缺氧、低(無)糖、缺氧/復氧對神經元的影響，建立體外缺氧/復氧損傷模型。在此基礎上，通過LDH漏出率的測定、MTT比色法、流式

2、細胞術、Hoechst 33258染色法、RT-PCR、Westem blotting的方法研究HGF對皮層神經元缺氧/復氧損傷的影響及其與MEK/ERK1/2、PI-3K/Akt信號傳導途徑，凋亡相關分子Bcl-2、Bcl-xL和Bax的關系。利用基因芯片技術研究HGF對缺氧/復氧損傷神經元缺氧信號通路的影響。用實時定量PCR的方法進一步驗證這些差異表達基因中的6個(Myb12、Cygb、Birc5、Cdc42、IL1β、NOS2)，

3、并通過Western blotting檢測ItGF對缺氧/復氧損傷神經元Cygb和NOS2蛋白表達水平的影響。 結果： 1.缺氧、低(無)糖及缺氧/復氧對神經元的影響 (1)MTT比色實驗的結果顯示，缺氧1h，神經元細胞活力即降低，而LDH漏出率從缺氧4h開始增高，且隨缺氧時間的延長，細胞活力呈降低的趨勢，LDH漏出率呈增高的趨勢。 (2)低糖(葡萄糖濃度為2.5mmol/L)、無糖處理均誘導神經元損傷，

4、且無糖組的損傷較低糖組更為嚴重。 (3)缺氧條件下培養(yǎng)，各組對缺氧耐受性由高到低排列依次為正常糖組>低糖組>無糖組。 (4)神經元缺氧/復氧與單獨缺氧比較，細胞活力降低，LDH漏出率和細胞凋亡率均增高，且隨復氧時間的延長(0～24h)，細胞活力呈下降趨勢，LDH漏出率及細胞凋亡率呈上升趨勢。 2.HGF對神經元缺氧/復氧損傷的影響 (1)用RT-PCR、Westem blotting的方法，在體外培養(yǎng)10

5、d的大腦皮層神經元和生后10d大鼠的大腦皮層組織均檢測到c-MetmRNA和c-Met蛋白的表達。 (2)HGF對缺氧8h/復氧12h(H8R12)損傷神經元的影響：HGF降低LDH漏出率的效應從20ng/ml開始出現，在60ng/ml達最高峰；增強細胞活力和抗凋亡效應均從10ng/ml開始出現，也是在60ng/ml達最高峰。此外，在缺氧處理前12h、缺氧處理前1h、缺氧即刻及復氧即刻加入終濃度為60ng/ml的HGF，均使H8

6、R12損傷神經元LDH漏出率降低，細胞活力增高，細胞凋亡率降低。其中缺氧處理前1h加入HGF在上述4個時間點中，增強細胞活力的效應為最強。c-Met抑制劑SU11274(5μmol/L)明顯阻斷了HGF的神經保護作用。 (3)HGF對氧糖剝奪2h/再灌注24h(OGD2R24)損傷神經元的影響：HGF增強細胞活力，降低LDH漏出率和細胞凋亡率的效應均從20ng/ml開始出現，在80ng/ml達最高峰。此外，在缺氧處理前12h、缺

7、氧處理前2h、缺氧即刻及復氧即刻4個時間點加入終濃度為80ng/ml的，HGF，均使細胞活力增高，細胞凋亡率降低。在復氧即刻加入HGF，對OGD2R24損傷神經元的LDH漏出率無明顯影響，其余三個時間點的LDH漏出率均降低。缺氧處理前2h加入HGF，在上述4個時間點中降低LDH漏出率和增強細胞活力的效應均為最大。c-Met抑制劑SU11274(5μmol/L)顯著抑制了HGF介導的神經保護效應。 3.HGF對缺氧/復氧神經元的保

8、護作用與ERK1/2、PI-3K/Akt通路及凋亡相關分子的關系 (1)Western blotting的結果顯示，HGF激活大腦皮層神經元MEK/ERKl/2與P13-K/Akt信號通路。 (2)MTT比色實驗、流式細胞術和Hoechst 33258染色的結果顯示，用MEK的抑制劑，U0126(500nmol/L)明顯阻斷了HGF對H8R12損傷神經元的促細胞存活和抗凋亡效應。P13-K的抑制劑，LY294002(LY

9、，10μmol/L)預處理抑制了HGF介導的神經保護作用。使用上述濃度的兩種抑制劑(不加HGF)對常氧條件下培養(yǎng)及H8R12處理神經元的細胞活力和凋亡率均無明顯影響。 (3)RT-PCR和Western blotting的結果顯示，H8/R12損傷后，皮層神經元Bcl-2、Bcl-xL的mRNA和蛋白表達水平明顯下調， BaxmRNA的表達顯著上調，而Bax蛋白的表達無明顯變化。用HGF(60ng/ml)預處理明顯上調了缺氧/復

10、氧損傷神經元Bel-2、Bcl-xL的mRNA和蛋白表達水平，但對Bax mRNA和蛋白的表達無顯著影響。 4.HGF對缺氧/復氧神經元缺氧信號通路的影響 (1)對缺氧信號通路基因芯片顯示的差異表達基因進行功能分類，涉及代謝、信號傳導、細胞生長、轉錄、細胞骨架、凋亡等方面。 (2)實時定量PCR的結果顯示，神經元H8/R12損傷后Myb12mRNA、Cygb mRNA、Birc5 mRNA表達下調，Cdc42 m

11、RNA、Nos2mRNA、IL1βmRNA表達上調；HGF(60ng/ml)預處理能明顯抑制H8R12損傷神經元Myb12 mRNA、Cygb mRNA、Birc5 mRNA水平的降低，以及Cdc42 mRNA、NOS2 mRNA、IL1β mRNA水平的增高。 (3)Western blotting的結果顯示，H8R12損傷后，神經元Cygb蛋白表達水平明顯降低，NOS 2蛋白表達顯著增高，HGF預處理能明顯上調H8/R12損

12、傷神經元Cygb蛋白的表達，下調NOS2蛋白表達水平。 結論： 1.缺氧、低(無)糖可引起皮層神經元損傷，且與持續(xù)時間密切相關，皮層神經元對缺氧、低(無)糖十分敏感。 2.低(無)糖能加重缺氧導致的皮層神經元損傷，呈一定的時效依賴性，無糖對缺氧的耐受性低于正常糖和低糖。 3.缺氧后復氧可加重缺氧引起的皮層神經元損傷和細胞凋亡，呈一定的時效依賴關系。 4.c-Met受體存在于大腦皮層組織和體外培養(yǎng)的

13、大腦皮層神經元。 5.HGF對體外培養(yǎng)的皮層神經元缺氧/復氧損傷具有直接的保護作用，并呈一定的量效和時效關系。 6.MEK/ERK1/2通路的激活在HGF對皮層神經元缺氧/復氧損傷的保護效應中起重要作用，P13-K/Akt通路也參與了這一效應。 7.Bcl-2和Bcl-xL可能參與了HGF對皮層神經元缺氧/復氧損傷的保護作用。 8.初步明確皮層神經元缺氧/復氧損傷后，缺氧信號通路相關基因的變化規(guī)律。