白介素-15對膿毒癥大鼠骨骼肌蛋白分解代謝的影響.pdf

1、研究背景:
　　 膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)(燒)傷、休克、外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，來勢兇險，病情演變很快，常并發(fā)多器官功能障礙綜合癥(MODS)，有極高病死率。負(fù)氮平衡為膿毒癥狀態(tài)機(jī)體代謝的典型特征，占機(jī)體細(xì)胞干重50％的骨骼肌蛋白的高分解代謝是其主要原因之一。
　　 膿毒癥狀態(tài)下骨胳肌蛋白高分解代謝涉及一個錯綜復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。泛素系統(tǒng)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白降解途徑，在機(jī)體代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。研究認(rèn)為膿毒癥大鼠骨骼肌蛋白

2、高分解代謝與泛素-蛋白酶系統(tǒng)密切相關(guān)。膿毒癥時機(jī)體釋放多種因子(生長因子，白介素家族因子，腫瘤壞死因子等)，能直接或間接誘導(dǎo)泛素系統(tǒng)激活，影響骨骼肌蛋白降解率。白介素-15(IL-15)具有廣泛的生物學(xué)活性，在骨骼肌中高表達(dá)。研究表明IL-15能夠明顯逆轉(zhuǎn)腫瘤惡病質(zhì)小鼠模型骨骼肌重量下降趨勢，并能夠下調(diào)泛素(Ub)活性，影響蛋白質(zhì)降解。目前關(guān)于IL-15對膿毒癥狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)分解代謝影響的研究罕見，機(jī)制尚不清楚。研究認(rèn)為TNF-α能

3、夠明顯增強(qiáng)泛素系統(tǒng)的表達(dá)及活性，促進(jìn)骨骼肌蛋白降解。相關(guān)研究也提示IL-15和TNF-α的釋放與活性存在著相互作用，IL-15對泛素-蛋白酶途徑的影響可能由TNFα介導(dǎo)，也可能是由IL-15直接作用于泛素-蛋白酶途徑，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。
　　 研究目的:
　　 基于以上研究結(jié)果，本課題試圖通過動物實(shí)驗(yàn)，擬進(jìn)一步描述、探討膿毒癥狀態(tài)下機(jī)體骨骼肌蛋白降解規(guī)律、IL-15、泛素系統(tǒng)蛋白及基因的表達(dá)水平變化情況和互相

4、作用機(jī)制。摸索外源性IL-15干預(yù)的最佳時間點(diǎn)及劑量。提出假設(shè)：外源性IL-15干預(yù)能下調(diào)機(jī)體膿毒癥骨骼肌蛋白質(zhì)降解率，為膿毒癥高代謝惡病質(zhì)的防治探索新的途徑。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立穩(wěn)定的膿毒癥大鼠模型：CLP術(shù)后觀察大鼠一般生命體征參數(shù)，各臟器損傷程度，觀察模型是否建立穩(wěn)定。
　　 2.健康SD大鼠隨機(jī)分為CLP組(A組)、假手術(shù)對照組(B組)。于觀察時間點(diǎn)(2h、4h、8

5、h、12h、24h)活殺大鼠離體孵育伸趾長肌，高效液相質(zhì)譜法測定總蛋白(Tyr)和肌纖維蛋白(3-MH)降解率；取血液、骨骼肌和臟器，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、組織芯片免疫組織化學(xué)染色法(IH)和實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析Ub和IL-15的基因和蛋白表達(dá)變化規(guī)律。
　　 3.外源性IL-15干預(yù)的時間及劑量摸索：根據(jù)前期研究結(jié)果，選擇CLP術(shù)后8小時為時間效應(yīng)點(diǎn)。CLP術(shù)后6h(C組)、7.5h(

6、D組)、8h(E組)外源性IL-15干預(yù)組于干預(yù)時間點(diǎn)大鼠尾靜脈注射高純度重組鼠IL-15(100μg/Kg)，其余時間點(diǎn)及非干預(yù)組(F組)注射相同劑量生理鹽水。于12h活殺取標(biāo)本，分析指標(biāo)變化。求IL-15干預(yù)的最佳時間點(diǎn)(T0)。
　　 4.外源性IL-15干預(yù)：膿毒癥大鼠(CLP術(shù)后)分為2組，對照組(G組)在T0(CLP術(shù)后Th)尾靜脈注射生理鹽水；干預(yù)組(H組)大鼠在T0尾靜脈注射高純度重組IL-15，劑量為M0，分析

7、指標(biāo)差異。
　　 5.TNFα單克隆抗體干預(yù)：對照組(I組)單純給予外源性IL-15干預(yù)，于CLP后2h及8h予以生理鹽水注射。外源性IL-15+TNFα單抗干預(yù)組(J組)：在CLP后7h尾靜脈注射重組IL-15同時，于CLP后2h及8h，分兩次尾靜脈注射TNFα單抗(3mg/kg)。分析指標(biāo)差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論：
　　 1.采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥大鼠模型。術(shù)后隨時間延長，CLP組大鼠一般

8、狀態(tài)惡化，血漿中內(nèi)毒素水平進(jìn)行性增高。對照組參數(shù)穩(wěn)定。兩組比較差異顯著(P＜0.01)。病理光鏡顯示CLP術(shù)后大鼠肝臟、腎臟細(xì)胞壞死、核裂解，骨骼肌細(xì)胞斷裂。
　　 2.A組膿毒癥大鼠CLP術(shù)后血漿、組織內(nèi)IL-15和泛素的蛋白及m RNA總體表達(dá)水平高于B組(P＜0.01)，均先升高后期有所下降。較之B組，A組大鼠CLP術(shù)后血清IL-15蛋白于術(shù)后8h達(dá)最高峰后下降；骨骼肌中IL-15和Ub m RNA水平于術(shù)后4h增高，12

9、h至高峰；骨骼肌蛋白代謝率隨時間延長進(jìn)行性增高(P＜0.01)，24h達(dá)最高峰。推斷CLP術(shù)后8h為有效代償時間窗，確定為時間效應(yīng)點(diǎn)。
　　 3.摸索性外源性IL-15干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，較F組，C組、D組、E組大鼠骨骼肌代謝率降低，血清IL-15濃度升高，血清Ub濃度降低(P＜0.01)，推斷最佳干預(yù)時間點(diǎn)(T0)為CLP后7h。骨骼肌肌纖維蛋白代謝率與血清IL-15濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.41374，P＜0.05)，與Ub濃度呈正相

10、關(guān)(r=0.76247，P＜0.01)。
　　 4.外源性重組IL-15細(xì)胞因子干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，較G組，H組蛋白代謝率明顯降低(P＜0.01)，H組血漿、組織中IL-15蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)。說明IL-15能有效拮抗骨骼肌蛋白的降解效應(yīng)。
　　 5.兩組血漿組織中IL-15和Ub表達(dá)水平差異有顯著性(P＜0.01)，I組骨骼肌肌纖維蛋白代謝率較J組低(P＜0.01)，但是骨骼肌總蛋白代謝率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明IL-15

11、對泛素-蛋白酶途徑的影響可能由TNF-α介導(dǎo)，但不是唯一通路。提示骨骼肌細(xì)胞存在IL-15特異受體。
　　 小結(jié):
　　 本研究建立了穩(wěn)定的①膿毒癥大鼠模型；②體外骨骼肌有氧孵育系統(tǒng)；③高效液相-質(zhì)譜法檢測三甲基組氨酸和酪氨酸的方法；④分析IL-15和泛素系統(tǒng)基因和蛋白表達(dá)的方法與條件。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果描述了膿毒癥病理狀態(tài)下，機(jī)體IL-15和泛素基因、蛋白水平的表達(dá)規(guī)律，觀察到膿毒癥時IL-15和Ub的表達(dá)與骨骼

12、肌的代謝率相關(guān)。病理狀態(tài)下IL-15的轉(zhuǎn)錄翻譯被激活。通過外源性重組IL-15因子的干預(yù)，初步摸索了IL-15干預(yù)的時間點(diǎn)(CLP后7h)和劑量(100μg/Kg)。實(shí)驗(yàn)顯示IL-15干預(yù)能降低膿毒癥骨骼肌蛋白代謝率，推測CLP后7h為最佳干預(yù)時間點(diǎn)。通過TNF-a阻斷劑干預(yù)，認(rèn)為IL-15對Ub系統(tǒng)的影響可能由TNF-α介導(dǎo)，但不是唯一通路。在危重病狀態(tài)下，內(nèi)源性IL-15的合成遠(yuǎn)不能滿足機(jī)體的消耗，刺激合成以及外源性的補(bǔ)充十分必要。