整合素αvβ3對(duì)乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的作用.pdf

1、整合素是由α(120～185kD)和β(90～110kD)兩個(gè)亞單位形成的異二聚體。整合素具有兩種主要功能，一為傳遞細(xì)胞內(nèi)外之信息，另一為細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的連接橋梁。乳腺癌轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者的主要致死原因。近年來(lái)對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究顯示：由整合素介導(dǎo)的細(xì)胞間及與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用等信號(hào)事件在乳腺腫瘤形成、生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移諸多過(guò)程中起了重要作用。 本實(shí)驗(yàn)研究乳腺癌細(xì)胞株中整合素αvβ3受體的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附、遷移能力的影響，

2、探討整合素αvβ3對(duì)腫瘤細(xì)胞跨膜信號(hào)的調(diào)節(jié)作用，以及采用抗整合素αvβ3抗體對(duì)裸鼠乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移模型的治療實(shí)驗(yàn)，最后檢測(cè)整合素αvβ3表達(dá)與乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移關(guān)系，尋求臨床應(yīng)用抗整合素αvβ3抗體治療乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的可行性。 第一部分整合素αvβ3在乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞粘附、遷移的影響 [目的]檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞株MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s整合素αvβ3的表達(dá)狀況，通過(guò)細(xì)胞粘附、遷移實(shí)驗(yàn)了

3、解整合素αvβ3對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用。 [材料和方法]細(xì)胞培養(yǎng)：MCF-7細(xì)胞采用含10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，MDA-MB-231細(xì)胞采用含10﹪胎牛血清的1640培養(yǎng)，MDA-MB-435s細(xì)胞采用含10﹪胎牛血清的L15培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞株MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s整合素αvβ3的表達(dá)。 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)：采用玻璃體結(jié)合蛋白細(xì)胞粘附試

4、劑盒。玻璃體結(jié)合蛋白濃度梯度為(0.01～20μg/ml)，上述細(xì)胞按3.5×105/ml，每孔0.1ml細(xì)胞懸液置于96孔板中，37℃，5﹪CO2孵箱孵育2小時(shí)，染色后，全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀550nm讀數(shù)。 細(xì)胞遷移試驗(yàn)：采用玻璃體結(jié)合蛋白定量細(xì)胞遷移試驗(yàn)試劑盒。各取2.5×105MDA-MB-231、MDA-MB-435s細(xì)胞，抗整合素αvβ3抗體LM60925μg/ml封閉，對(duì)照組PBS替代抗體。置細(xì)胞于孔徑8μm的Boyde

5、n小室中，37℃，5﹪CO2孵箱孵育24小時(shí)，染色后，全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀檢測(cè)。 [結(jié)果]人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s整合素αvβ3的表達(dá)情況顯示：整合素αvβ3抗體LM609與上述細(xì)胞株結(jié)合，熒光表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞比率分別為：0.73﹪、85.88﹪、96.42﹪。按熒光檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5﹪為整合素αvβ3受體陽(yáng)性，表明MCF-7細(xì)胞膜上整合素αvβ3受體為陰性，MDA-MB-231、MDA-

6、MB-435s細(xì)胞膜上整合素αvβ3受體陽(yáng)性。 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示：MDA-MB-231、MDA-MB-435s細(xì)胞粘附能力在玻璃體結(jié)合蛋白濃度為0.05～1μg/ml時(shí)，隨濃度梯度增強(qiáng)。MCF-7細(xì)胞則無(wú)明顯變化。 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示；整合素αvβ3受體陽(yáng)性細(xì)胞具有對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白--玻璃體結(jié)合蛋白的趨觸性，這種特性使其能穿過(guò)微孔遷移。經(jīng)抗體處理后，細(xì)胞遷移能力減弱(MDA-MB-231t=12.3p＜0.01、MDA-M

7、B-435st=22.5p＜0.01、MCF-7t=0.45p＞0.05)。 [結(jié)論]整合素αvβ3在惡性程度較高的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s中呈高表達(dá)。而在MCF-7細(xì)胞株中低表達(dá)。細(xì)胞膜上整合素αvβ3受體陽(yáng)性的細(xì)胞具有較強(qiáng)的粘附性和遷移能力，此類(lèi)腫瘤細(xì)胞更具侵襲、轉(zhuǎn)移能力。這種能力會(huì)隨著受體的封閉而減弱。 第二部分整合素αvβ3對(duì)腫瘤細(xì)胞跨膜信號(hào)的調(diào)節(jié) [目的]檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子

8、、粘著斑激酶磷酸化水平的變化，以及腫瘤細(xì)胞凋亡狀況，了解整合素αvβ3對(duì)腫瘤細(xì)胞跨膜信號(hào)的調(diào)節(jié)作用。 [材料和方法]細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子檢測(cè)：MDA-MB-231、MDA-MB-435s接種于涂有玻璃體結(jié)合蛋白的24孔板中，對(duì)照組為牛血清白蛋白。加含Ca2+PBS，加鈣離子熒光探針fluo-3AM，共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果按256級(jí)灰度值計(jì)算。 Westernblot方法檢測(cè)粘著斑激酶磷酸化水平。MDA-MB-231、MDA-M

9、B-435s細(xì)胞株經(jīng)玻璃體結(jié)合蛋白(1μg/ml)處理，對(duì)照組PBS。細(xì)胞內(nèi)粘著斑激酶發(fā)生酪氨酸磷酸化的情況。 腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：用抗整合素αvβ3抗體LM609(25μg/ml)封閉人乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435s細(xì)胞株后，對(duì)照組PBS替代抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡的狀況。 [結(jié)果]共聚焦顯微鏡觀察MDA-MB-231細(xì)胞株中，細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子濃度玻璃體結(jié)合蛋白組(灰度值106)較BSA對(duì)照組

10、(灰度值43)增高146.5﹪，而在MDA-MB-435s細(xì)胞株中鈣離子濃度玻璃體結(jié)合蛋白組(灰度值111)較BSA對(duì)照組(灰度值57)增高94.7﹪。顯示整合素αvβ3受體陽(yáng)性的細(xì)胞與其配體結(jié)合后，可促使細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子濃度顯著增高。 Westernblot方法檢測(cè)結(jié)果顯示：MDA-MB-231細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)粘著斑激酶發(fā)生酪氨酸磷酸化表達(dá)較對(duì)照組增加98.2﹪，MDA-MB-435s細(xì)胞株的表達(dá)較對(duì)照組增加84.5﹪。 經(jīng)

11、流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期可以看出：MDA-MB-231細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率為8.47﹪，對(duì)照組為0.38﹪。MDA-MB-435s細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率為6.25﹪，對(duì)照組為1.14﹪。 [結(jié)論]經(jīng)玻璃體結(jié)合蛋白作用后，通過(guò)激活磷脂酶C，磷脂酶C分解磷酯酰肌醇二磷酸產(chǎn)生肌醇三磷酸刺激細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放，以及由離子通道介導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子濃度增高。自由鈣離子濃度可調(diào)節(jié)多種酶活性，并能作為第二或第三信使激活激酶鏈

12、(促分裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基端激酶)傳入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)。 整合素αvβ3與其配體玻璃體結(jié)合蛋白作用后，可以增強(qiáng)粘著斑激酶發(fā)生酪氨酸磷酸化，粘著斑激酶作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)因子，與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲有關(guān)。其磷酸化后，能加強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，增加細(xì)胞侵襲力。 缺乏特定的激素或生長(zhǎng)因子將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞外基質(zhì)也象這些激素和生長(zhǎng)因子一樣是細(xì)胞存活因子。腫瘤細(xì)胞--基質(zhì)間接觸被壞會(huì)引起細(xì)胞凋亡，這

13、種現(xiàn)象稱作失巢凋亡。隨著整合素αvβ3受體的封閉增加腫瘤細(xì)胞凋亡。 第三部分整合素αvβ3在乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移中作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) [目的]研究抗整合素αvβ3抗體LM609對(duì)裸鼠乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移模型的治療作用。 [材料和方法]3周齡BALB/c雌性裸鼠，體重17～21g。MDA-MB-231、MDA-MB-435s細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)組用LM609，25μg/ml封閉受體，對(duì)照組PBS替代抗體。單細(xì)胞懸液左心室內(nèi)注射。一周后

14、，實(shí)驗(yàn)組從尾靜脈按2mg/kg注射LM609。對(duì)照組為PBS。2周后處死，收集骨髓。提取總RNA，KT19為模板，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)。 [結(jié)果]用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組作相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)起始量為橫坐標(biāo)，循環(huán)閾值(cyclethreshold,Ct)為縱坐標(biāo)相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。其斜率為-3.365,相關(guān)系數(shù)為0.967，擴(kuò)增效率98.2﹪。內(nèi)參β-actin所測(cè)得實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組Ct值的差值為△Ct。各實(shí)驗(yàn)組KT19所測(cè)得Ct值與△

15、Ct值的差值為△△Ct。將循環(huán)閾值處擴(kuò)增量定為1，則實(shí)驗(yàn)組相對(duì)起始量=(1+AE)-△△Ct，對(duì)照組相對(duì)起始量=(1+AE)-Ct，AE為擴(kuò)增效率。將相對(duì)起始量進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果為，MDA-MB-231細(xì)胞組t=15.87(P＜0.05)。MDA-MB-435s細(xì)胞組t=19.29(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異。由整合素αvβ3受體陽(yáng)性細(xì)胞制作的裸鼠乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移模型中，經(jīng)LM609處理后，可顯著減少乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。

16、 [結(jié)論]本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用Lm609對(duì)乳腺癌細(xì)胞株受體封閉，可抑制裸鼠模型中整合素αvβ3受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞骨髓微轉(zhuǎn)移。因而提示，可采用抗整合素αvβ3抗體來(lái)抑制乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移。 第四部分乳腺癌中整合素αvβ3表達(dá)與乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及其意義[目的]檢測(cè)乳腺癌標(biāo)本整合素αvβ3表達(dá)及乳腺癌患者骨髓微移狀況，研究其相關(guān)關(guān)系。 [材料和方法]69例女性乳腺癌患者，術(shù)中采集骨髓。RT-PCR，KT

17、19檢測(cè)骨髓微轉(zhuǎn)移。腫瘤組織整合素αvβ3受體的檢測(cè)采用SABC免疫組織化學(xué)方法，10例乳腺纖維瘤患者標(biāo)本作對(duì)照。 [結(jié)果]乳腺癌標(biāo)本免疫組化結(jié)果，以細(xì)胞膜著色呈棕黃色為整合素αvβ3陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞＞10﹪為結(jié)果陽(yáng)性。整合素αvβ3陽(yáng)性患者30例，占43.5﹪；陰性患者39例，占56.5﹪。乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性患者22例，占31.9﹪；陰性患者占68.1﹪?？ǚ綑z驗(yàn)，X2=9.564，P＜0.05。兩者有顯著