索拉菲尼誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化(liver fibrosis)是一種損傷-愈合反應(yīng)，其主要特點是慢性肝損傷后的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積。ECM主要來源于活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，它在纖維化致病過程中起關(guān)鍵性作用，因此，對其深入研究為抗纖維化治療提供了潛在、重要的理論基礎(chǔ)，誘導(dǎo)HSC死亡可能成為有效的抗肝纖維化策略。理想的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡策略是在誘導(dǎo)HSC死亡的同時不引起肝臟炎

2、癥反應(yīng)。程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)就是一種有組織的、受控的細(xì)胞清除過程;PCD與“壞死”不同，并不引起炎癥反應(yīng)。
　　 程序性細(xì)胞死亡是指細(xì)胞受到某些因素刺激或接受某種信號后，細(xì)胞為了維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程，是生長發(fā)育和維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。根據(jù)垂死細(xì)胞(dying cells)的不同形態(tài)學(xué)特征可分為:凋亡和自噬性細(xì)胞死亡(autophagic cell deat

3、h，ACD)，又稱作“Ⅰ和Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡”。近年來，自噬性細(xì)胞死亡被受廣大學(xué)者所關(guān)注。自噬(autophagy)是一種溶酶體降解過程，它可將損傷的或過剩的細(xì)胞元件分解成基本的活性成分使之可再利用。自噬過程包括合成包繞靶目標(biāo)的膜型結(jié)構(gòu)、自噬體形成、與溶酶體融合形成自噬溶酶體、酸性溶酶體水解酶降解靶目標(biāo)。凋亡(apoptosis)是機(jī)體在一定的生理或病理條件下，經(jīng)由啟動內(nèi)部機(jī)制，最終導(dǎo)致內(nèi)源性內(nèi)切酶激活，自己結(jié)束生命的過程;它是主動死亡

4、過程，在整個過程中涉及到一系列凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化，同時細(xì)胞發(fā)生特征性形態(tài)學(xué)改變。
　　 此外，最新研究發(fā)現(xiàn)自噬與凋亡間有復(fù)雜的相互聯(lián)系，因為參與自噬和凋亡過程的某些分子存在交叉。諸如:兩種關(guān)鍵的自噬蛋白Beclin1和Atg5，在凋亡途徑中也發(fā)揮了重要的作用;同時參與凋亡的caspases和Bcl-2家族成員也可通過裂解或綁定Beclin1的方式調(diào)控自噬。最新研究報道表明，自噬通過降解長壽蛋白和細(xì)胞器促使活化HSC存活，通過

5、降解HSC內(nèi)脂滴為其活化提供能量，促使肝纖維化發(fā)生。亦有研究表明:生育三烯酚類通過誘導(dǎo)活化的胰星狀細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮其抗胰纖維化的作用。因此，自噬對細(xì)胞的作用具有兩面性，可以說是一把雙刃劍，既可作為細(xì)胞生長的“朋友”，又可能成為殺死細(xì)胞“敵人”，這取決于疾病進(jìn)展的不同階段、細(xì)胞周圍環(huán)境的變化和治療干預(yù)措施的不同。已有大量的研究證實:多種抗腫瘤藥物bufalin、cannabidiol、cucurbitacin等均可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自

6、噬性細(xì)胞死亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用。
　　 索拉菲尼是一種靶向性Raf/ERK信號通路多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑，它可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增生并誘導(dǎo)其凋亡，是FDA批準(zhǔn)的最早應(yīng)用于治療肝癌的口服藥。索拉菲尼靶向抑制Raf絲氨酸/蘇氨酸激酶以及下游的MEK/ERK信號通路，抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并與其對PI3K/Akt/p70S6K信號通路的磷酸化的抑制作用有關(guān)。有報道:索拉菲尼干預(yù)多種腫瘤細(xì)胞后可誘導(dǎo)其自噬水平增高，這

7、與索拉菲尼調(diào)控多條自噬相關(guān)信號通路有關(guān)，諸如:MAPK/ERK、Akt/mTOR/p70S6K和JNK/c-Jun信號通路等。早期的研究表明索拉菲尼可顯著降低大鼠肝纖維化模型的門脈壓力和血管形成，新的研究發(fā)現(xiàn)索拉菲尼具有潛在的抗肝纖維化功效。本課題組的研究已證實索拉菲尼可抑制活化的HSC增殖并誘導(dǎo)其凋亡。然而，索拉菲尼的抗肝纖維化作用及其與程序性細(xì)胞死亡間的關(guān)系尚不明確。
　　 由此我們推測索拉菲尼的抗肝纖維化作用，除通過其抑制

8、HSC增殖并誘導(dǎo)HSC凋亡外，還可能通過誘導(dǎo)HSC自噬性細(xì)胞死亡實現(xiàn)。本課題旨在研究索拉菲尼是否可誘導(dǎo)人HSC-LX2細(xì)胞株以及大鼠原代HSC發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，并探討自噬和凋亡間的關(guān)系及可能的分子機(jī)制。
　　 實驗由以下三部分組成:
　　 第一部分:索拉菲尼誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡和自噬性細(xì)胞死亡
　　 目的:研究索拉菲尼對HSC凋亡和自噬性細(xì)胞死亡的影響。
　　 方法:采用Ⅳ型膠原酶和鏈酶原位灌注肝組織和N

9、ycodenz梯度密度離心技術(shù)分離提取大鼠原代HSC，應(yīng)用α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色和熒光染色方法鑒定原代HSC。索拉菲尼(2.5μmol/L，5.0μmol/L，10.0μmol/L)干預(yù)HSC-LX2細(xì)胞株6h、12h或24 h，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法檢測細(xì)胞存活率、碘化丙啶(Propidium iodide， PI)/膜聯(lián)蛋白(AnnexinⅤ)聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢

10、測HSC凋亡率。HSC-LX2細(xì)胞株預(yù)孵育凋亡抑制劑Z-VAD-FEK(20μmol/L)或壞死抑制劑IM-54(10μmol/L)1 h后，與5μmol/L索拉菲尼共孵育11h，MTT法檢測細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexin V+細(xì)胞數(shù)和pI+細(xì)胞數(shù)百分率變化。索拉菲尼(5μmol/L)干預(yù)原代HSC或HSC-LX2細(xì)胞株12h后，透射電鏡和吖啶橙染色法觀察HSC中自噬的激活，激光共聚焦顯微鏡觀察自噬標(biāo)記蛋白LC3的變化，RT-

11、PCR法檢測索拉菲尼對HSC中自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg7和Atg5 mRNA的影響，Western Blot法檢測索拉菲尼對HSC自噬相關(guān)蛋白表達(dá)LC3、Beclin1、Atg7、Atg5和p62/SQSTM1表達(dá)的影響，以及自噬抑制劑3-MA(5 mmol/L)抑制自噬對這些蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 ①HSC獲得率為1.4～2.3×107/只，細(xì)胞純度和存活率均大于90％。剛提取的HSC呈圓形，胞

12、漿內(nèi)富含脂滴，在波長328 nm的熒光顯微鏡下觀察，能激發(fā)出藍(lán)色熒光。HSC培養(yǎng)14天后，靜止的細(xì)胞被激活變?yōu)樗笮位蛐切?，富含維生素A的脂滴消失。
　　 ②大鼠原代HSC性質(zhì)鑒定。未活化HSC內(nèi)不表達(dá)α-SMA;當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)14天后，完全活化的HSC胞漿內(nèi)有α-SMA表達(dá)。
　　 ③索拉菲尼抑制HSC-LX2細(xì)胞存活率并促凋亡。MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示索拉菲尼呈時間與濃度依賴性抑制HSC存活率并促凋亡，其中5μmol/L

13、索拉菲尼干預(yù)12h后細(xì)胞存活率即由對照組的100.00％降低至50.19±0.19(P＜0.001)，而凋亡率(41.22±2.425％)較對照組（7.73±1.34％）顯著增高(P＜0.001)。
　　 ④索拉菲尼誘導(dǎo)HSC細(xì)胞非凋亡性細(xì)胞死亡。預(yù)孵育Z-VAD-FEK后細(xì)胞存活率和單用索拉菲尼組間無差異且均較對照組降低(P＜0.001)，但PI+細(xì)胞率(54.19±4.03％)顯著高于Annexin V+細(xì)胞率(10.22±

14、2.03％)(P＜0.001)。預(yù)孵育IM-54后細(xì)胞存活率(50.36±4.73％)仍較對照組降低(P＜0.001)，pI+細(xì)胞率和Annexin V+細(xì)胞率較索拉菲尼組均無明顯差異。
　　 ⑤透射電鏡和吖啶橙染色觀察HSC形態(tài)變化。應(yīng)用5μmol/L索拉菲尼干預(yù)HSC12 h后，電鏡細(xì)胞呈現(xiàn)自噬特征，諸如大量雙層膜囊泡，囊泡內(nèi)包含部分胞漿物質(zhì)，可見包裹的細(xì)胞器如線粒體，溶酶體激活，雙層膜囊泡與溶酶體融合;熒光顯微鏡下可見大量

15、點狀橙紅色熒光顆粒散布于胞漿內(nèi)細(xì)胞核周圍。
　　 ⑥索拉菲尼誘導(dǎo)HSC細(xì)胞形成“自噬潮”(autophagic flux)。HSC預(yù)孵育溶酶體抑制劑E64d和pepstatin A1 h后，與5μmol/L索拉菲尼共孵育11h，Western blot顯示預(yù)孵育E64d和pepstatin A組LC3Ⅱ/Ⅰ較單用索拉菲尼組進(jìn)一步增加;激光共聚焦顯微鏡下預(yù)孵育E64d和pepstatin A組原代HSC中LC3綠色斑點進(jìn)一步增多。

16、
　　 ⑦RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因Beclin1，Atg7和Atg5的mRNA表達(dá)增加。
　　 ⑧Western blot法檢測索拉菲尼干預(yù)后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5和LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增加，p62表達(dá)顯著下降;而3-MA可逆轉(zhuǎn)上述改變。
　　 結(jié)論:索拉菲尼可通過誘導(dǎo)凋亡和自噬性細(xì)胞死亡兩種途徑，促使HSC發(fā)生細(xì)胞死亡。HSC啟動自噬性死亡途徑，對細(xì)胞自身的胞漿物質(zhì)及細(xì)胞器進(jìn)行吞噬、消化和清除

17、。
　　 第二部分:索拉菲尼誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡及其與凋亡的關(guān)系
　　 目的:探討索拉菲尼誘導(dǎo)HSC凋亡和自噬性細(xì)胞死亡間的相互關(guān)系。
　　 方法:應(yīng)用5μmol/L索拉菲尼干預(yù)不同時間點(0 h，3h，6h，12h，24h)或不同濃度索拉菲尼(2.5μmol/L，5μmol/L，10μmol/L)干預(yù)HSC-LX212h，Western blot法檢測自噬和凋亡標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Cleaved-PA

18、RP變化。不同濃度索拉菲尼(2.5μmol/L，5μmol/L，10μmol/L)干預(yù)12h，吖啶橙染色或PI/Annexin V聯(lián)合標(biāo)記后流式細(xì)胞術(shù)檢測AVOs或凋亡細(xì)胞數(shù)變化;Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3，-8變化。預(yù)孵育Z-VAD-FEK(20μmol/L)1h后，與10μmol/L索拉菲尼共孵育11h。Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/

19、Ⅰ和Beclin1變化。自噬抑制劑3-MA(5 mmol/L)預(yù)孵育1h后，與5μmol/L索拉菲尼共孵育11h。流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率，Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3，-8變化。應(yīng)用Atg5-siRNA技術(shù)干擾LX2后，5μmol/L索拉菲尼干預(yù)12h，Western blot法檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白變化。
　　 結(jié)果:
　　 ①索拉菲尼誘導(dǎo)自噬先

20、于凋亡。Western blot顯示:索拉菲尼干預(yù)24 h后Cleaved-PARP顯著增加，而LC3Ⅱ/Ⅰ水平在干預(yù)6h后即出現(xiàn)顯著性增加，12h達(dá)高峰，24 h恢復(fù)到基線水平。
　　 ②不同濃度索拉菲尼對自噬和凋亡的影響不同。Western blot顯示索拉菲尼(5μmol/L)組LC3Ⅱ/Ⅰ顯著增加(P＜0.01);而索拉菲尼(10μmol/L)組LC3Ⅱ/Ⅰ明顯下降，同時Cleaved-PARP顯著增加(P＜0.01)。

21、流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示:索拉菲尼(5μmol/L)組AVOs細(xì)胞百分率(62.19±6.11％)顯著多于凋亡細(xì)胞百分比(38.28±4.91％)，（P＜0.05），索拉菲尼(10μmol/L)組凋亡水平(95.90±3.33％)較索拉菲尼(5μmol/L)組顯著增加(P＜0.01)，而自噬水平(73.18±5.04％)無明顯改變。
　　 ③活化的caspases裂解Beclin1。Western Blot顯示:索拉菲尼(10μmol

22、/L)組cleaved-caspase-3，-8表達(dá)增強(qiáng)的同時Beclin1明顯下降。Z-VAD-FMK可逆轉(zhuǎn)索拉菲尼(10μmol/L)誘導(dǎo)的Beclin1水平降低，并且使LC3Ⅱ/Ⅰ增加。
　　 ④抑制自噬可促進(jìn)索拉菲尼誘導(dǎo)的凋亡。預(yù)孵育3-MA后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:凋亡細(xì)胞率(81.94±5.34％)較單一索拉菲尼干預(yù)組(42.34±3.60％)顯著增多（P＜0.05）。Western blot顯示預(yù)孵育3-MA后可顯著

23、增加凋亡相關(guān)蛋白水平，如cleaved-caspase-3，-8和cleaved-PARP。Atg5-siRNA可抑制索拉菲尼(5μmol/L)誘導(dǎo)的LC3Ⅱ/Ⅰ增加，同時使cleaved-caspase-3，-8和cleaved-PARP表達(dá)增加。
　　 結(jié)論:索拉菲尼干預(yù)HSC后自噬性細(xì)胞死亡先于凋亡而發(fā)生，當(dāng)?shù)蛲鰡雍笞允尚约?xì)胞死亡被抑制，這種作用可能與活化的caspases斷裂Beclin1有關(guān)。阻斷索拉菲尼誘導(dǎo)的自噬后

24、可代償性增加凋亡水平，而這種凋亡的增加是作為一種程序性細(xì)胞死亡的替代方式。
　　 第三部分:索拉菲尼對肝星狀細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 目的:探討索拉菲尼對HSC細(xì)胞內(nèi)Akt/mTOR/p70S6K和JNK/c-Jun信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:5μmol/L索拉菲尼干預(yù)HSC-LX2細(xì)胞株(0 h，0.5 h，1.5 h，3h，6 h,12 h,24 h), Western blot檢

25、測 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、JNK和p-JNK的蛋白表達(dá)變化，激光共聚焦顯微鏡觀察p-c-Jun核轉(zhuǎn)位。以5μmol/L索拉菲尼、25μmol/L LY294002干預(yù)HSC-LX2細(xì)胞株12h，吖啶橙染色或PI/Annexin V聯(lián)合標(biāo)記后流式細(xì)胞術(shù)檢測AVOs和凋亡細(xì)胞數(shù)變化。以5μmol/L索拉菲尼、10μmol/LSP600125干預(yù)HSC-LX2細(xì)胞株12h，Western

26、blot檢測JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ變化。
　　 結(jié)果:
　　 ①索拉菲尼抑制HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)Akt/mTOR/p70S6K信號通路的磷酸化。索拉菲尼干預(yù)后p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K分別較對照組降低。
　　 ②索拉菲尼可通過Akt/mTOR/p70S6K信號通路誘導(dǎo)凋亡。流式細(xì)胞術(shù)顯示LY294002+索拉菲尼

27、組細(xì)胞凋亡率(69.44±6.71％)較索拉菲尼組(38.22±4.66％)增加了53％;而LY294002對AVOs細(xì)胞百分率無影響。
　　 ③索拉菲尼通過JNK/c-Jun信號通路誘導(dǎo)自噬，并激活HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)JNK/c-Jun信號通路。索拉菲尼干預(yù)后p-JNK/JNK較對照組顯著增加，激光共聚焦顯微鏡觀察p-c-Jun增加并轉(zhuǎn)位入核。SP600125抑制了JNK/c-Jun信號分子的磷酸化水平，同時也抑制了索拉菲尼誘