GSK-3β活性對(duì)宮頸癌演進(jìn)、凋亡及對(duì)放、化療敏感性影響的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、研究背景
　　宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的常見(jiàn)婦科腫瘤，在發(fā)展中國(guó)家居?jì)D科惡性腫瘤的首位。雖然我國(guó)對(duì)宮頸癌的防治已取得很大成效，近年來(lái)隨著人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染率的上升和社會(huì)生活的變化，宮頸癌的發(fā)病率呈增高趨勢(shì)，近20年來(lái)發(fā)病明顯趨于年輕化，且宮頸腺癌比例增加。因?yàn)橄侔┮自缙诎l(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)放療的敏感性較差，對(duì)化療容易產(chǎn)生耐藥，因此治療難度加大，預(yù)后不理想。因而尋找一種科學(xué)、可行的途徑來(lái)增強(qiáng)放、化療療效，改善預(yù)后成為宮頸癌治

2、療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　糖原合成激酶-3（glycogensynthesiskinase-3，GSK-3）是一多功能絲氨酸/蘇氨酸類激酶，廣泛地分布在迄今研究過(guò)的所有真核生物中，在哺乳動(dòng)物中包括兩個(gè)亞型，即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β是糖原代謝過(guò)程中的重要限速酶，除了可以在胰島素調(diào)控下磷酸化肝糖原合成酶（glycogensynthesis）并使之失活外，GSK-3β還在多個(gè)重要信號(hào)通路中扮演了關(guān)鍵角色，例如Wnt/

3、β-cateninpathway，PI3K/AKTpathway，Hedgehogpathway，在蛋白合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡以及腫瘤發(fā)生等方面都扮演了重要角色。
　　研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β與乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，且在研究宮頸癌發(fā)病機(jī)理相關(guān)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，我們發(fā)現(xiàn)GSK-3β是這些通路共同的交叉點(diǎn)，說(shuō)明GSK-3β在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用；但由于GSK-3β均不是

4、研究的主要目的蛋白，而僅是被提及，且有關(guān)GSK-3β在宮頸癌發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，結(jié)合在其他惡性腫瘤中的研究，GSK-3β在新的抗腫瘤治療中將成為一個(gè)頗具魅力的靶點(diǎn)。關(guān)于GSK-3β在宮頸癌中功能及作用機(jī)制的研究，將為探討宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制提供一種新的思路與方法。
　　研究目的
　　觀察GSK-3β表達(dá)及活性改變對(duì)宮頸癌演進(jìn)、凋亡和對(duì)放、化療敏感性的影響，并通過(guò)尋找其可能作用途徑，探討外

5、源性改變GSK-3β活性或表達(dá)對(duì)宮頸癌放、化療增敏的可能性，為以GSK-3β為靶基因治療宮頸癌提供理論依據(jù)。
　　研究方法
　　1)采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)GSK-3β在正常宮頸組織、宮頸癌前病變組織、宮頸惡性組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)、組織學(xué)分型和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；
　　2)利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法、RT-PCR、Westernblot法檢測(cè)Hela、Siha細(xì)胞中GSK-3β蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)

6、、定位情況；
　　3)LiCl抑制GSK-3β活性后，MTT法檢測(cè)Hela、Siha細(xì)胞耐藥性的改變；
　　4)Hoechst33342/PI染色檢測(cè)LiCl抑制GSK-3β活性對(duì)順鉑誘導(dǎo)Hela、Siha細(xì)胞凋亡的影響；
　　5)脂質(zhì)體法將3種表達(dá)不同GSK-3β活性的質(zhì)粒：pcDNA3/GSK-3β-S9A、pcDNA3/GSK-3β-WT、pcDNA3/GSK-3β-K85R轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞株，Wester

7、nblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率、各轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)GSK-3β的表達(dá)情況；
　　6)免疫熒光法再次驗(yàn)證瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞GSK-3β蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)分布，結(jié)合倒置顯微鏡觀察細(xì)胞表型的改變；
　　7)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比分析各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期變化，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；
　　8)經(jīng)過(guò)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela-S9A、Hela-WT、Hela-K85R、Hela-Vec細(xì)胞株，MTT比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察GSK-

8、3β蛋白對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；
　　9)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察GSK-3β-S9A蛋白高表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞放療敏感性的影響；MTT法檢測(cè)6GyX線照射后24、36、48、72和96h對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；
　　10)Westernblot檢測(cè)不同劑量X線照射后，Hela細(xì)胞中GSK-3β及其下游β-catenin蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；
　　11)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外藥物敏感性分析，計(jì)算Hela

9、-S9A、Hela-WT、Hela-K85R、Hela-Vec及Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值，分析GSK-3β-S9A蛋白高表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞順鉑敏感性的影響；MTT比色法檢測(cè)5μg/ml順鉑作用后12、24、36、48和72h對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；
　　12)Westernblot檢測(cè)5μg/ml順鉑作用48h后，Hela細(xì)胞中GSK-3β及其下游β-catenin蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；
　　13)Westernblot檢

10、測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2的表達(dá)及活性。
　　研究結(jié)果
　　1)GSK-3β蛋白是普遍存在的，隨著從癌前病變發(fā)展至癌，GSK-3β蛋白表達(dá)量基本呈遞減趨勢(shì)，腺癌中的表達(dá)量明顯降低（p<0.05）；pGSK-3βSer9蛋白在病變組織的表達(dá)量均高于正常組織；
　　2)Hela細(xì)胞中，GSK-3β主要定位于胞漿，胞核中幾乎沒(méi)有；而Siha細(xì)胞中，GSK-3β胞漿、胞核中均有表達(dá)；
　　3)LiCl預(yù)處

11、理Hela、Siha細(xì)胞6h，可明顯增加其順鉑耐藥性，且Hela細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性更強(qiáng)；
　　4)Hoechst33342/PI染色證明LiCl預(yù)處理Hela、Siha細(xì)胞6h可明顯降低順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生；
　　5)細(xì)胞總蛋白提取物中，Hela、Siha細(xì)胞中總GSK-3β蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，而Hela細(xì)胞，處于活性抑制狀態(tài)的pGSK-3βSer9表達(dá)量明顯低于Siha細(xì)胞，說(shuō)明在Hela細(xì)胞中有更多有活性狀態(tài)的GSK-

12、3β；
　　6)成功建立四組表達(dá)不同活性狀態(tài)的pcDNA3.0/GSK-3β質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株Hela-S9A、Hela-WT、Hela-K85R及陰性對(duì)照Hela-Vec細(xì)胞株，Westernblot檢測(cè)表明：各組細(xì)胞在GSK-3β蛋白分子量46KDa處均有明顯蛋白表達(dá)條帶，GSK-3β轉(zhuǎn)染組細(xì)胞株中總GSK-3β蛋白水平均有明顯升高；但各組的pGSK-3βSer9蛋白水平比陰性對(duì)照組有明顯降低；
　　7)GSK-3β-

13、S9A轉(zhuǎn)染可明顯抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)，并將細(xì)胞周期阻滯于G2-M期，從而阻礙DNA合成；透射電鏡下觀察也證實(shí)，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)呈典型凋亡的形態(tài)學(xué)改變；
　　8)免疫熒光法檢測(cè)不同活性狀態(tài)的GSK-3β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后GSK-3β蛋白定位情況。GSK-3β在正常的Hela細(xì)胞主要在胞漿表達(dá)，胞核中幾乎沒(méi)有；Hela-WT的細(xì)胞中，GSK-3β蛋白還是以胞漿表達(dá)為主，Hela-K85R細(xì)胞中，除了個(gè)別由于轉(zhuǎn)染毒性凋亡的細(xì)胞，胞漿和胞核均有表達(dá)

14、，以胞核表達(dá)較多，而導(dǎo)入GSK-3β-S9A突變體細(xì)胞中，GSK-3β幾乎以胞核表達(dá)為主；
　　9)不同劑量X線照射后，Hela-S9A細(xì)胞克隆形成率及細(xì)胞活力隨著X線照射劑量的升高而下降，有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，細(xì)胞活力及存活率均明顯低于未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞（p<0.01）；6GyX線照射后Hela-S9A細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加，呈現(xiàn)良好的時(shí)間依賴關(guān)系，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞；
　　10)

15、Westernblot檢測(cè)結(jié)果提示：Hela-S9A細(xì)胞中GSK-3β蛋白表達(dá)水平隨著X線照射劑量的升高而明顯升高，有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系；且同一劑量下，均比未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞明顯增加；而β-catenin蛋白表達(dá)明顯下降；
　　11)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率均隨順鉑藥物濃度升高而下降；在同一藥物濃度下，Hela-S9A細(xì)胞存活率明顯下降，48h的IC50值為（0.38±0.02）μg/ml；5μg/ml順鉑作用后各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著

16、時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，呈現(xiàn)良好的時(shí)間依賴關(guān)系；各檢測(cè)點(diǎn)Hela-S9A細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞；
　　12)Westernblot檢測(cè)結(jié)果提示：Hela-S9A細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)水平隨著順鉑作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯升高，呈現(xiàn)良好的時(shí)間依賴關(guān)系；且同一劑量下，均比未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞明顯增加；而β-catenin蛋白表達(dá)明顯下降；
　　13)在Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，構(gòu)成性激活GSK-3β即G

17、SK-3β-S9A的高表達(dá)可誘導(dǎo)促凋亡基因Bax的高表達(dá)及抑凋亡基因Bcl-2的低表達(dá)，進(jìn)而有助于抑制前體癌蛋白β-catenin表達(dá)。
　　結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下：
　　1)GSK-3β在宮頸癌中呈低表達(dá)，且GSK-3β的表達(dá)隨宮頸癌分期的升高而降低；
　　2)胞核內(nèi)pGSK-3βSer9表達(dá)減弱，是Hela細(xì)胞區(qū)別于Siha細(xì)胞的生物學(xué)特征之一；
　　3)GSK-3β功能發(fā)揮與其細(xì)胞定位密切相關(guān)，LiCl通過(guò)引

18、起細(xì)胞核內(nèi)pGSK-3βSer9表達(dá)增強(qiáng)可提高Hela、Siha細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性；
　　4)構(gòu)成性激活GSK-3β可明顯抑制細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)X線放療、順鉑化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)放、化療對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，并具有較好的劑量-效應(yīng)及時(shí)相性關(guān)系；
　　5)在Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，構(gòu)成性激活GSK-3β的可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2所介導(dǎo)的凋亡途徑來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲，GSK-3β起著關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控