亞洲玉米螟幾丁質酶的晶體結構與抑制劑設計.pdf

1、糖基水解酶18家族(GH18)幾丁質酶(chitinase，EC3.2.1.14)隨機催化水解幾丁質(chitin)和殼糊精(chitodextrins)的β-1，4糖苷鍵。該酶廣泛分布于細菌、真菌、昆蟲、植物和哺乳動物等生物體內，在營養(yǎng)、病原菌入侵、節(jié)肢動物蛻皮、免疫和防御等生理過程中發(fā)揮著重要作用。解析并獲得GH18幾丁質酶的結構和功能的關系對于疾病控制、植物保護和藥物設計均具有重要意義。
　　與其他物種相比，昆蟲是GH18幾

2、丁質酶含量最豐富的生物體，包含8個分支。其中groupⅠ幾丁質酶負責昆蟲蛻皮時舊表皮的幾丁質降解，對于昆蟲的生長發(fā)育至關重要。目前尚無昆蟲幾丁質酶結構與功能的報導。本論文以農業(yè)害蟲亞洲玉米螟的groupⅠ幾丁質酶OfChtI為研究對象，主要獲得以下結論:
　　1) OfChtI具有獨特的結構特征
　　重組表達的全長OfChtI不穩(wěn)定，我們因此重組表達并結晶催化域（Of ChtI-CAD），并解析得到分辨率為1.7(A)的Of

3、ChtI-CAD晶體結構(PDB登錄號3w4r)。
　　晶體結構分析表明OfChtI-CAD包含核心域和幾丁質插入域。核心域為典型的(β/α)8折疊桶結構，催化殘基指紋序列144DxDxE148位于β4和α4之間的loop上，而幾丁質插入域形成活性裂縫的一面墻。
　　OfChtI-CAD擁有長且兩端開放的底物結合裂縫，依次排列9個可能結合底物糖基的芳香族氨基酸殘基。其不同于所有已知結構的幾丁質酶的特征是:在底物結合裂縫的末端

4、，有四個芳香族氨基酸（Phe159、Phe194、Trp240和Tyr290）形成一個疏水平面。單點突變體F159A、F194A、W241A、Y290A、雙突變體F194A/W241A、F159A/Y290A和四點突變體F159A/F194A/W241A/Y290A結合幾丁質的能力均較野生型OfChtI-CAD低。其中四點突變結合能力最低，僅為野生型的40％。說明這個獨特的疏水平面的生理功能與OfChtI-CAD的幾丁質結合能力正相關。

5、
　　2) OfChtI具有隨機水解幾丁寡糖的內切活性
　　為了研究OfChtI-CAD水解底物的特性，我們首先利用熱力學方法分析了幾丁寡糖在OfChtI-CAD活性裂縫中的結合情況。實驗結果表明幾丁寡糖(GlcNAc)3-6與OfChtI-CAD結合的焓變、熵變均小于零，且|-T△S|＞|△H|，表明結合均為熵驅動（焓變也產生一部分貢獻），說明結合主要伴隨著蛋白與底物的構像變化和水分子的排出。從(GlcNAc)3到(Glc

6、NAc)6，每增加一個糖單元，自由能降低1.0 kcal mol-1，表明OfChtI催化域包含至少6個糖基結合位點。
　　為了分析OfChtI-CAD的催化特性，我們利用浸泡法，將OfChtI-CAD的晶體與幾丁寡糖(GlcNAc)6共孵育獲得分辨率為1.77(A)的復合物晶體結構（PDB登錄號3wl1）。OfChtI-CAD的結構在結合配基前后具有很好的重疊性，說明幾丁寡糖的進入沒有改變酶的活性裂縫以及整體結構。復合物結構中存

7、在兩個糖分子:其一為(GlcNAc)3，占據活性裂縫的-1、-2和-3位點;另一個為(GlcNAc)2，位于+1和+2位點。結合在-1位點的GlcNAc呈現能量不利的船式構像，很可能是催化反應剛剛完成時的狀態(tài):即產物已經離去，催化相關的Asp146仍然與-1 GlcNAc作用。因我們之前的研究表明OfChtI是從底物非還原端開始水解底物，所以(GlcNAc)3應該是(GlcNAc)6的水解產物，因此可以推斷OChtI具有內切性質。

8、>　　3)寡聚葡萄糖胺是OfChtI的抑制劑
　　GH18家族幾丁質酶催化水解底物時采用底物輔助保留機制，-1位GlcNAc的乙?；鳛橛H核基團進攻C1異頭碳。這個過程將導致-1 GlcNAc的嚴重扭曲，從而處于能量不利的不穩(wěn)定構型。如果-1糖是脫乙?；?，那么結合GlcN可能是能量上有利的?；谶@個假說，我們首次研究并獲得了寡聚葡萄糖胺(GlcN)2-7抑制劑，其IC50值在μM-mM水平。
　　同時我們也測試了這些聚糖的

9、體內活性。給亞洲玉米螟5齡幼蟲注射(GlcN)2-7混合物，85％的幼蟲不能完成幼蟲到蛹的生理過程，并在10天后死亡。因OfChtI是負責昆蟲蛻皮過程中表皮幾丁質的降解，所以該實驗結果說明(GlcN)2-7可能在昆蟲體內抑制了OfChtI的活性。
　　4)寡聚葡萄糖胺對OfChtI的抑制機理
　　為了研究寡聚葡萄糖胺抑制劑對OfChtI的抑制機理，我們利用熱力學方法分析了寡聚葡萄糖胺(GlcN)2-7與Of ChtI的結合過

10、程。結果表明這些抑制劑與OfChtI結合的焓變均小于零，且|△H|＞|-T△S|，表明反應均為焓驅動，抑制劑與OfChtI的結合伴隨著氫鍵和/或靜電作用的形成。(GlcN)5、(GlcN)6和(GlcN)7與OfChtI結合的Kd值相似，說明(GlcN)6,7比(GlcN)5多出的糖基沒有對親和力產生貢獻。
　　為了研究這些聚糖抑制作用的分子機制，我們通過浸泡法分別獲得了OfChtI-CAD與(GlcN)5（PDB登錄號3wqv）

11、和(GlcN)6(PDB登錄號3wqw)的復合物晶體結構，分辨率均為2.0(A)。晶體結構表明(GlcN)6的五個糖與(GlcN)5中的五個糖基結合在相同的亞位點上，即-1、-2、-3、-4和-5亞位點。抑制劑復合物OfChtI-CAD-(GlcN)5與底物復合物OfChtI-CAD-(GlcNAc)2/3的結構比較顯示抑制劑和底物在-1和-2位點的結合存在明顯差異。為了研究這兩個位點對抑制劑結合的作用，我們構建了突變體E148Q和F3