RNA干擾GATA-3基因表達(dá)對急性哮喘小鼠Th17細(xì)胞分化及致炎機(jī)能的影響.pdf

1、支氣管哮喘是一種全球性疾病，無地域和種族的局限性，也無年齡和性別的明顯差異。支氣管哮喘病因復(fù)雜，是以具有間歇性、可逆性的氣道阻塞、支氣管高反應(yīng)性和淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤氣道粘膜下層為特征性的慢性氣道炎癥。關(guān)于氣道炎癥的發(fā)生，以往的研究普遍認(rèn)為主要是免疫源性炎癥，但其具體機(jī)制尚不十分清楚還有待進(jìn)一步的研究。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為輔助性T淋巴細(xì)胞兩種亞型(Th1和Th2)的失衡是哮喘發(fā)生的重要機(jī)制，具體則表現(xiàn)為Th2細(xì)胞的活化亢進(jìn)，這是哮喘發(fā)病機(jī)

2、制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Th1、Th2是由共同的前體細(xì)胞，即Th0分化而來，轉(zhuǎn)錄因子GATA-3是特異性調(diào)控Th0分化，起著Th1/Th2轉(zhuǎn)換開關(guān)作用的關(guān)鍵因子之一，IFN-γ和IL-4則分別是Th1和Th2類細(xì)胞因子的主要代表。
　　 近年來，氣道炎癥的Th17細(xì)胞因素日益受到重視。Th17細(xì)胞是機(jī)體中一類能產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞，RORγt是其特異性轉(zhuǎn)錄因子。IL-17A是近期發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，是屬于一個獨特類型的具有多種功能的細(xì)

3、胞因子，可以通過誘導(dǎo)釋放的促炎癥因子和促中性粒細(xì)胞動員的細(xì)胞因子協(xié)調(diào)局部組織的炎癥，在炎癥性疾病和自身免疫性疾病，特別是在哮喘過敏性氣道炎癥中發(fā)揮重要作用。
　　 RNA干擾(RNAi)是高度保守的基因沉默技術(shù)，它在功能上與基因敲除或基因沉默一致，但比基因敲除技術(shù)更為方便快捷。在本研究中，我們利用RNA干擾技術(shù)在急性哮喘小鼠模型中探討GATA-3對RORγt表達(dá)以及對Th17細(xì)胞分化及其致炎機(jī)能的影響。研究的主要目的之一是探討R

4、ORγt對急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞分化和致炎機(jī)能的影響；研究的主要目的之二是通過RNA干擾GATA-3基因表達(dá)，觀察急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt的表達(dá)變化及其亞群Th17細(xì)胞分化和致炎機(jī)能是否受到影響。通過此研究，我們希望發(fā)現(xiàn)GATA-3在哮喘發(fā)生過程中Th2/Th17淋巴細(xì)胞分化調(diào)控失衡現(xiàn)象中的作用及可能機(jī)制，以期為哮喘防治提供新思路和理論依據(jù)。
　　 目的：通過補(bǔ)充完善急性哮喘動物模型

5、評價標(biāo)準(zhǔn)，鑒定改良建立的急性哮喘小鼠模型是否成功。
　　 方法：將35只SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組：急性哮喘組(20只)以O(shè)VA致敏、激發(fā)；正常對照組(15只)以等體積的PBS代替OVA致敏、激發(fā)；兩組均在末次激發(fā)24 h后處理小鼠。處理包括：1.查看小鼠的一般行為活動；2.乙酰膽堿激發(fā)小鼠后，有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應(yīng)性；3.BALF行細(xì)胞學(xué)分類、計數(shù)；4.觀察肺組織的病理變化；5.計算脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)和

6、Th17細(xì)胞的陽性率；6.測定BALF和脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-17的濃度。
　　 結(jié)果：
　　 (1)急性哮喘組小鼠出現(xiàn)類似于人的哮喘發(fā)作癥狀，而正常對照組小鼠表現(xiàn)基本正常。
　　 (2)與正常對照組相比，急性哮喘組小鼠對乙酰膽堿的刺激反應(yīng)明顯，濃度反應(yīng)曲線明顯上移(P<0.01)。
　　 (3)急性哮喘組小鼠BALF白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比明顯高于正

7、常對照組(P均<0.01)。
　　 (4)與正常對照組相比，急性哮喘組小鼠肺組織支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(P<0.01)。
　　 (5)急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)和TH17細(xì)胞陽性率明顯高于正常對照組(P均<0.01)。
　　 (6)與正常對照組相比，急性哮喘組小鼠BALF和脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-17的濃度明顯增高(P均<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　

8、 (1)改良并建立了急性哮喘小鼠動物模型，并且模型鑒定成功。
　　 (2)成功完善了急性哮喘小鼠動物模型的評價標(biāo)準(zhǔn)。
　　 目的：探討急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt表達(dá)的變化以及RORγt對急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞分化和致炎機(jī)能的影響。
　　 方法：首先研磨小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液后裂解紅細(xì)胞，再予免疫磁珠分離小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞，懸于加有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，

9、加入ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時后行real-time PCR、Westernblotting測定小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞中RORγt的表達(dá)，流式細(xì)胞儀測定Th17細(xì)胞陽性率，ELISA法檢測脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度，并分析急性哮喘組小鼠RORγt的表達(dá)與Th17細(xì)胞陽性率及IL-17濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞RORγt的mRNA

10、及蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組(P<0.01)。
　　 (2)急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞陽性率明顯高于正常對照組(P<0.01)。
　　 (3)急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度明顯高于正常對照組(P<0.01)。
　　 (4)急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt的mRNA表達(dá)與Th17細(xì)胞陽性率、IL-17的濃度均呈正相關(guān)(r=0.854，0.872；P均

11、<0.01)。
　　 (5)急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt的蛋白表達(dá)與Th17細(xì)胞陽性率、IL-17的濃度均呈正相關(guān)(r=0.902，0.891；P均<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt的表達(dá)顯著增高。
　　 (2)急性哮喘小鼠脾源性Th17細(xì)胞的分化和致炎機(jī)能顯著增高。
　　 (3)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt的表

12、達(dá)與Th17細(xì)胞的分化和致炎機(jī)能呈正相關(guān)。
　　 目的：通過RNA干擾GATA-3基因表達(dá)，觀察急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt的表達(dá)及其亞群Th17細(xì)胞分化和致炎機(jī)能是否受到影響。
　　 方法：通過基因瞬時轉(zhuǎn)染的方法，將三對siRNA-GATA-3片段和陰性對照片段分別轉(zhuǎn)染入急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞72小時后，進(jìn)行RT-PCR和Western blotting檢測GATA-3的表達(dá)，篩選出其中具有

13、最佳沉默效果的片段。再將此片段轉(zhuǎn)染入急性哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞，ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時后，行real-time PCR和Western blotting分別檢測正常對照組小鼠、未轉(zhuǎn)染siRNA組哮喘小鼠和轉(zhuǎn)染最佳沉默片段siRNA組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中GATA-3和RORγt的表達(dá)，以及行流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法分別檢測Th17細(xì)胞陽性率和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度，并分析轉(zhuǎn)染最佳沉默片段siRNA組急性哮

14、喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中GATA-3的表達(dá)與RORγt的表達(dá)、Th17陽性率及IL-17濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在三對siRNA片段中以siRNA-GATA-3-201沉默效果最為明顯(P<0.01)。
　　 (2)轉(zhuǎn)染siRNA-GATA-3-201組急性哮喘小鼠的脾源性CD4+T細(xì)胞中GATA-3 mRNA的表達(dá)明顯低于正常對照組小鼠和未轉(zhuǎn)染siRNA組哮喘小鼠(P均<0.01)；轉(zhuǎn)染s

15、iRNA-GATA-3-201組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中GATA-3蛋白的表達(dá)明顯低于正常對照組小鼠和未轉(zhuǎn)染siRNA組哮喘小鼠(P均<0.01)。
　　 (3)轉(zhuǎn)染siRNA-GATA-3-201組急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt mRNA的表達(dá)明顯高于正常對照組小鼠和未轉(zhuǎn)染siRNA組哮喘小鼠(P均<0.01)；轉(zhuǎn)染siRNA-GATA-3-201組哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt蛋白的表達(dá)明顯高于

16、正常對照組小鼠和未轉(zhuǎn)染siRNA組哮喘小鼠(P均<0.01)。
　　 (4)轉(zhuǎn)染siRNA-GATA-3-201組急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17的陽性率明顯高于正常對照組小鼠和未轉(zhuǎn)染siRNA組急性哮喘小鼠(P均<0.01)。
　　 (5)轉(zhuǎn)染siRNA-GATA-3-201組急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度明顯高于正常對照組小鼠和未轉(zhuǎn)染siRNA組哮喘小鼠(P均<0.01)

17、　　 (6)轉(zhuǎn)染siRNA-GATA-3-201組急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中GATA-3的mRNA表達(dá)與RORγt的mRNA表達(dá)、Th17陽性率及IL-17的濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.622，-0.692，-0.877；P均<0.01)。
　　 (7)轉(zhuǎn)染siRNA-GATA-3-201組急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中GATA-3的蛋白表達(dá)與RORγt的蛋白表達(dá)、Th17陽性率及IL-17的濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.8

18、94，-0.728，-9.886；P均<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)RNA干擾技術(shù)可應(yīng)用于支氣管哮喘小鼠動物模型，實現(xiàn)對靶基因的沉默。
　　 (2)RNA干擾GATA-3基因表達(dá)可能促進(jìn)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中RORγt的表達(dá)。
　　 (3)RNA干擾GATA-3基因表達(dá)可能促進(jìn)急性哮喘小鼠脾源性Th17細(xì)胞的分化和致炎機(jī)能。
　　 (4)RNA干擾GATA-3基因表達(dá)可能通