Syndecan-1、FGF2-FGFR1在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、目的:
　　Syndecan來自希臘文Syndein，意思將細胞微環(huán)境的成分與細胞骨架結合起來。它屬于跨膜蛋白聚糖(proteoglycans，PGs)類細胞粘附分子，核心蛋白通過共價鍵連接4-7條糖氨聚糖側鏈(glycosaminoglycan，GAG)。 Syndecan家族包括4個成員:Syndecan-1(SDC-1，CD-138)，-2，-3，-4。機體不同組織表達不同的Syndecan成員，具有不同的結構和功能。SDC

2、-1和-4表達于多種細胞，包括上皮、內皮、血管平滑肌;SDC-2在培養(yǎng)的肺、皮膚纖維細胞中表達;SDC-3表達限于中央神經系統(tǒng)及外周神經。
　　Syndecans介導細胞—細胞和細胞—間質的粘附而影響細胞形態(tài)、細胞生長特征、細胞遷移、信號傳導及血凝。這些生物效應被認為多由HS鏈介導，HS可連接許多配體，例如生長因子(GF)，細胞因子，細胞外基質(ECM)分子，蛋白酶，蛋白抑制劑等。通過與可溶性GF連接，syndecans作為低親合

3、力輔助受體，積聚配體并將之遞呈給高親合力受體[1]。SDC-1是syndecan家族中研究最多的成員，主要存在于上皮細胞并被廣泛研究。通過HS鏈（結合于胞外域），SDC-1與許多ECM分子相結合（膠原，纖維結合蛋白，thrombospondin，tenascin等）。胞內域與肌動蛋白微細纖維有關，因此，SDC-1是一種間質固定者，將細胞結合于基質，而且通過HS鏈，SDC-1與FGFS結合且作為FGFS的輔助受體來影響細胞行為。
　

4、　bFGF也叫FGF-2，是一種肝素結合GF的原型與syndecans連接，當通過syndecan的HS鏈定位于細胞間質時仍具活性[2]。bFGF與HS間的作用被認為會導致bFGF的雙分子化，協(xié)助GF與FGF受體結合，從而受體雙分子化，致使胞內信號傳導體系被激活[3]。bFGF是一個多功能細胞分子，而在多種細胞和組織內發(fā)揮作用[4]，它是血管新生因素，可影響細胞遷移，在多個進化過程中是一個細胞分化因素。本實驗是為了探討FGF2/FGFR

5、1，SDC-1在卵巢病變中的表達（蛋白水平和mRNA水平），FGF2對卵巢癌細胞生長的作用以及FGF2對卵巢癌細胞中SDC-1表達的影響，最終討論FGF2/FGFR1，syndecan-1在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　一、檢測FGF-2/FGFR1在上皮性卵巢癌組織中的表達情況
　　應用免疫組化方法檢測正常卵巢、良性卵巢瘤、卵巢交界瘤和上皮性卵巢癌原發(fā)灶以及其大網膜轉移灶中FGF2/FGFR1的表

6、達，應用RT-PCR檢測組織中其mRNA表達水平。
　　二、檢測FGF-2對SKOV3細胞株增殖的影響
　　培養(yǎng)SKOV3細胞，加入FGF2100pg/ml，FGF21ng/ml，FGF210ng/ml and10％FCS，應用trypan blue排除實驗來評估細胞的增殖活力;在細胞中加入FGF-2100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml和FGF2-NA100μg/ml，應用BrdU標記法來評估細胞DNA合成狀況。應

7、用SPSS13.0對結果進行統(tǒng)計分析，P＜0.05則差異存在統(tǒng)計學意義。
　　三、檢測syndecan-1在上皮性卵巢癌組織中的表達情況
　　應用免疫組化方法檢測正常卵巢、良性卵巢瘤、卵巢交界性囊腺瘤和上皮性卵巢癌原發(fā)灶以及其大網膜轉移灶中syndecan-1的表達，應用RT-PCR檢測其在組織中mRNA表達水平。
　　四、檢測FGF-2對SKOV3細胞株中syndecan-1表達的影響
　　培養(yǎng)SK-OV-3細

8、胞應用RT-PCR方法檢測mRNA變化，加入FGF2及其中和抗體FGF2-NA，分析FGF2對syndecan-1 mRNA表達的影響，結果應用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、FGF2及FGFR1表達情況:免疫組化:在原發(fā)灶:FGF2見于3例(10％)卵巢良性病變（1例巧囊，2例畸胎瘤），位于腺細胞胞漿，評分1-2;見于9例(36％)EOC(3例Ⅰ期，6例Ⅲ期)，評分2-3，位

9、于胞漿，正常卵巢及交界性卵巢囊腺瘤未見FGF2表達。卵巢良性病變和EOC兩組間FGF2的表達存在統(tǒng)計學差異;FGFR1見于2例(6.7％)卵巢良性病變（2例巧囊），評分1-2;見于8例(32％)EOC(2例Ⅰ期，6例Ⅲ期)，評分1-2，位于腺細胞胞漿，正常卵巢及交界性卵巢囊腺瘤未見FGFR1表達。卵巢良性病變和EOC兩組間FGFR1的表達有統(tǒng)計學差異;在大網膜轉移灶:FGF2見于4例EOC(stageⅢ)和1例卵巢交界性囊腺瘤，評分1-

10、2，染色部位是腺細胞的胞漿。FGFR1見于9例EOC(stageⅢ)和1例卵巢交界性囊腺瘤，評分1-2，染色部位是腺細胞的胞漿;RT-PCR:良性卵巢瘤和EOC兩組間FGF2/FGFR1的mRNA變化與免疫組化結果一致，即EOC組高表達，而且兩組間的差異有統(tǒng)計學意義;細胞增殖實驗:空白對照組的活細胞數是32100±3829/孔(48h)，39300±3750/孔(96h); FGF-2100pg/ml組的活細胞數是44600±5852/

11、孔(48h)，68499±4421/孔(96h);FGF-21ng/ml組的活細胞數是71500±4705/孔(48h)，97499±2923/孔(96h);FGF-210ng/ml組的活細胞數是101000±6333/孔(48h)，139000±3306/孔(96h);10％FCS組的活細胞數是141000±4222/孔(48h)，181000±4212/孔(96h)。組間活細胞數存在統(tǒng)計學差異，P＜0.05; DNA合成實驗:FGF

12、-2100pg/ml組的BrdU標記值是1.6858±0.39914;FGF-21ng/ml組的BrdU標記值是3.2538±1.0332;FGF-210ng/ml組的BrdU標記值是4.1634±0.9850;10％FCS組的BrdU標記值是5.46±1.3756，FGF2-NA100μg/ml組的BrdU標記值是0.2782±0.1079，組間的BrdU標記值存在統(tǒng)計學差異，P＜0.05。
　　2、syndecan-1表達情況

13、:免疫組化:卵巢病變原發(fā)灶中syndecan-1見于2例卵巢良性病變(6.7％)，（1例巧囊，1例畸胎瘤），位于腺細胞的胞膜和/或胞漿，評分1-2;見于1例卵巢交界性囊腺瘤(25％)，位于腺細胞的胞漿，評分1;見于8例(32％) EOC(stageⅢ)，其中7例染色位于腺細胞的胞膜和/或胞漿，2例染色位于間質，評分1-2，正常卵巢組織中未見表達。卵巢良性病變和EOC兩組間SDC-1的表達存在統(tǒng)計學差異;卵巢癌大網膜轉移灶中SDC-1見于

14、8例EOC（1例Ⅳ期，7例Ⅲ期），其中4例是癌巢腺上皮細胞染色(+)，7例間質染色(+)，3例腺上皮和間質染色(+)，腺細胞染色評分2，間質染色評分2-3;RT-PCR:正常卵巢和交界囊腺瘤組織中SDC-1未見明確表達，良性瘤和EOC組間存在統(tǒng)計學差異，與免疫組化結果一致，即EOC組高表達，而且兩組間的差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05;細胞培養(yǎng):在10％FCS培養(yǎng)卵巢癌細胞株SK-OV-3，syndecan1中等表達(48h)，高表達(9

15、6h)，隨著培養(yǎng)的時間呈現上揚趨勢。當細胞中加入FGF2時，SDC-1表達受抑制，而且沒有隨著時間而發(fā)生變化。當細胞中加入FGF2-NA時，SDC-1呈中等強度表達，隨著時間而減弱。
　　結論:
　　(1)FGF2在上皮性卵巢癌的增殖性生長中起到重要的促進作用，且呈劑量依賴模式，機制是誘導細胞的DNA合成。而其中和抗體FGF2-NA的應用可以抵消FGF2的促DNA合成效應，抑制細胞增殖，于是FGF2為我們提供了卵巢癌生物治療

16、的新靶點新思路，而中和性抗體的使用也許會成為一次有意義的嘗試。
　　(2)syndecan-1作為細胞表面黏附分子，不僅協(xié)助FGF2以促進細胞增殖和血管新生，促進上皮性卵巢癌細胞的生長，而且很可能在上皮性卵巢癌的侵襲性生長和病灶轉移中發(fā)揮作用。我們首次報導了上皮性卵巢癌原發(fā)灶及大網膜轉移灶中的表達特點，統(tǒng)計分析表明SDC-1在上皮性卵巢癌中表達升高，主要是腺細胞的胞膜和胞漿，而且與其在組織中的mRNA變化一致，故我們認為其調節(jié)在轉

17、錄前水平。同時我們發(fā)現了原發(fā)灶和轉移灶中SDC-1表達的差異:在原發(fā)灶主要是腺細胞表達，而轉移灶則主要是間質表達，提示間質中SDC-1的表達與卵巢癌的侵襲性生長與轉移有一定關系。FGF-inducible response element（FiRE）是位于SDC-1啟動子上游710 kb的一個長約280 bp的基因片段，受到生長因子作用而促進SDC-1的表達。在成纖維細胞中受到FGF-2的作用而使SDC-1的表達增強，但角質化細胞是受到