小鼠IL-33干擾RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)吸煙引起的小鼠肺部炎癥的作用.pdf

1、IL-33(inteleukin 33,IL-33)作為IL-1家族的一員,與其特異性受體ST2結(jié)合,參與固有免疫和獲得性免疫。IL-33主要通過促進(jìn)Th2細(xì)胞免疫反應(yīng),在自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)是一組以肺實(shí)質(zhì)與小氣道受到病理?yè)p害后,導(dǎo)致慢性不可逆性氣道阻塞、呼氣阻力增加、

2、肺功能不全為共同特點(diǎn)的肺疾病的總稱。吸煙是COPD發(fā)病的重要因素。
　　為了研究IL-33下調(diào)對(duì)相關(guān)炎癥反應(yīng)的影響,本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)特異性下調(diào)小鼠IL-33mRNA和蛋白的表達(dá),探討IL-33下調(diào)在吸煙誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型中的作用。研究?jī)?nèi)容如下:
　　一、根據(jù)GenBank中小鼠IL-33mRNA序列(AY905582),按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則,運(yùn)用GenScrip

3、t公司的siRNA design center siRNA Target Finder設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠IL-33的小干擾RNA(small inteference RNA,siRNA),同時(shí)加入酶切位點(diǎn)XhoI和MluI,由上海生工生物工程有限公司合成編碼siRNA序列的DNA單鏈。
　　二、運(yùn)用基因克隆技術(shù),將化學(xué)合成的靶向小鼠IL-33基因的短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA,shRNA),與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRNAT

4、in-H1.4/Retro連接。經(jīng)測(cè)序鑒定,重組載體中插入的shRNA序列和設(shè)計(jì)序列一致,證明我們成功構(gòu)建了小鼠IL-33 RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？漳孓D(zhuǎn)錄病毒載體作為陰性對(duì)照,經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞PT67,并以潮霉素B(Hygromycin B)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,收集、保存病毒上清。
　　三、收集的病毒上清經(jīng)尾靜脈注射作用于實(shí)驗(yàn)小鼠。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Reverse Tran

5、scription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測(cè)IL-33mRNA(messenger RNA,mRNA)在肺組織的表達(dá),應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)IL-33蛋白的表達(dá)。RT-PCR和免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示我們構(gòu)建的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRNATin-H1.4-IL-33a和-33b均可有效沉默小鼠肺組織中IL-33mRNA和蛋白的表達(dá),并且RT-

6、PCR結(jié)果顯示pRNATin-H1.4-IL-33a的沉默效果更為顯著,為以后研究IL-33在相關(guān)疾病中的作用提供了可行方法。HE染色結(jié)果顯示,IL-33干擾處理組的小鼠肺組織炎癥病理改變有所減輕,為研究IL-33在COPD中的作用提供了有用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　總之,在本研究中,我們成功構(gòu)建了針對(duì)小鼠IL-33的RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞PT67并篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),設(shè)計(jì)的shRNA具有明顯的沉