豬鏈球菌2型溶血素和38KDa蛋白的基因主要抗原區(qū)共表達(dá)及其免疫保護(hù)性試驗(yàn).pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus.suis)屬革蘭氏陽性、兼性厭氧球菌，按莢膜多糖分為35個(gè)血清型(1-34和1/2型)，其中豬鏈球菌2型是最主要的致病源且流行性廣泛，其次是血清型1/2，7，9和14型。能引起豬的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性漿膜炎、流產(chǎn)和膿腫等。目前臨床上較多應(yīng)用滅活苗和弱毒苗預(yù)防豬鏈球菌感染，滅活疫苗含有少量毒力因子，對(duì)致病菌攻擊的保護(hù)效率不理想，僅能保護(hù)同源菌株的感染。而弱毒苗雖然能產(chǎn)生較好的

2、抗體滴度，但存在毒力返強(qiáng)以及潛在的生物安全性問題。因此，廣譜性新型疫苗的研究成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要需求和保障。 根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)序列，設(shè)計(jì)合成了兩對(duì)特異性引物分別用于擴(kuò)增溶血素基因和38KDa基因主要抗原區(qū)基因。應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增豬鏈球菌2型四川分離株的相關(guān)基因，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T連接，提取陽性質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，同時(shí)進(jìn)行測(cè)序分析。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-Sly、pET32a-38KDa，大小為35K

3、u和43Ku。Western-blot分析結(jié)果表明，純化的重組蛋白與兔源豬鏈球菌2型陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。兩種重組蛋白分別具有Sly與38KDa蛋白的中和表位。確定誘導(dǎo)表達(dá)的兩種蛋白都具有免疫原性后，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行Nco I、B鋤H I和BamH I、Xho I雙酶切并純化，T<,4>DNA連接酶連接兩片段，通過用Sly上游引物和38KDa蛋白的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增串聯(lián)兩片段通過PCR串聯(lián)兩片斷，將目的片斷定向克隆到表達(dá)載體p

4、ET32a中，測(cè)序正確后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿BL21(DE3)，用終濃度為0.8mmol/LITG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果重組菌菌體裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳可檢測(cè)到相對(duì)分子量約為60Ku的重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后，免疫印跡法(Western-bloD證實(shí)該重組蛋白可以與兔源豬鏈球菌2型陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。用純化的重組表達(dá)蛋白pET32a-Sly，pET32a-38KDa和pET32a-Sly-38KD分別乳化免疫BALB/c小鼠，

5、評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)性，并和豬鏈球菌2型全菌滅活疫苗進(jìn)行比較。首免7天、14天后采血。2周后加強(qiáng)免疫1次，采血2次，并在每次免疫后采血測(cè)其效價(jià)。二免2周后，用致死劑量強(qiáng)毒豬鏈球菌2型四川分離株，江蘇分離株以及馬鏈球菌獸疫亞種菌株，腹腔和肌肉注射攻毒，并觀察攻毒試驗(yàn)后小鼠的臨床保護(hù)效應(yīng)和存活情況。結(jié)果表明，三種重組蛋白的各實(shí)驗(yàn)組IgG抗體效價(jià)之間無顯著差異(P>0.05)。免疫組Ⅰ組、Ⅲ組和Ⅳ組對(duì)不同分離株強(qiáng)毒豬鏈球菌2型以及感染馬鏈球菌獸疫亞

6、種安徽分離菌株的免疫保護(hù)性組間無顯著差異(P>0.05)，與Ⅱ組相比差異顯著(P<0.01)。各免疫組中與陽性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。免疫組死亡小鼠的平均存活時(shí)間延長(zhǎng)與陽性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)，菌苗效應(yīng)指標(biāo)中，免疫組Ⅲ組和Ⅳ組對(duì)S.suis2四川株保護(hù)力之間無差別；Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組隊(duì)S.suis-suis2江蘇株之間差異不顯著(P>0.05)；Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種安徽分離株保護(hù)力無差別。Ⅰ組棲對(duì)Ⅱ