經(jīng)門靜脈移植Feridex標記的HMSCs在大鼠肝內(nèi)的存活情況及示蹤研究.pdf

1、近年來，隨著干細胞日益受到重視，不少研究已經(jīng)表明，干細胞具有修復損傷性疾病及多向分化能力；在此基礎上，為了研究其修復病理的機制，實驗人員利用體外標記及移植等方法研究其在體內(nèi)的“運動軌跡”及存活情況。隨著標記物的更新?lián)Q代，超順磁氧化鐵(SPIO)由于具有良好的特性，同時配合MR成像系統(tǒng)的無創(chuàng)顯影，已經(jīng)成為現(xiàn)階段干細胞研究最重要的組成部分之一。動物的體外及體內(nèi)實驗已經(jīng)初步證明了干細胞在移植受體體內(nèi)的存活，并表明了移植干細胞在受體體內(nèi)的定位、

2、遷徙等情況，利用成人骨髓間充質(zhì)干細胞(HMSCs)進行研究也已有不少報導。然而，這種實驗方法，通過“鐵顆?！绷私庖浦驳母杉毎隗w內(nèi)的情況，并未直接明確移植細胞的存活。本實驗通過建立大鼠肝纖維化模型，體外菲力磁(Feridex，SPIO的一種)標記HMSCs，并通過門靜脈途徑移植入大鼠體內(nèi)，在不同時間點取大鼠肝組織，分別進行免疫組織化學及普魯士藍染色實驗，尋找兩種方法在不同時間點之間聯(lián)系及區(qū)別。主要研究內(nèi)容如下： 一、體外分離、培

3、養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞及Feridex標記 無菌條件下取成人骨髓，利用Percoll分離液進行梯度離心獲取HMSCs，體外培養(yǎng)、傳代及提純，再通過流式細胞技術檢測CD45/CD14/CD44/CD29/CD105等表面標志進行鑒定；并利用成脂、成骨誘導方法進一步驗證HMSCs向脂、向骨分化潛能。使用不同濃度Feridex標記HMSCs，利用鐵染色確定染色成功，同時通過MTT法(四甲基偶氮唑鹽比色法)確定標記的最合適Feridex濃

4、度。 結果顯示原代HMSCs生長較慢，以克隆集落方式增殖，培養(yǎng)早期細胞表現(xiàn)為短梭形、三角形或星形等多種形態(tài)。之后，細胞集落逐漸融合，細胞形態(tài)也漸趨均一，呈長梭形或纖維狀。至第12～14d，細胞已基本融合，形態(tài)均一，呈成纖維細胞樣生長。傳代后細胞生長明顯增快，形態(tài)及分布也更為均勻一致。流式細胞儀檢測第3～4代HMSCs，結果為：CD45-/CD14-/CD44+/CD29+/CD105+，符合HMSCs特征；經(jīng)成脂、成骨誘導液誘導

5、后，HMSCs可以成脂、成骨分化。MTT法結果：終濃度為25ug/ml的Feridex標記HMSCs后，細胞生長曲線與未標記組幾近重合；25ug/ml的Feridex標記HMSCs后1天，鐵染色提示染色均勻，藍染率將近100％。 二、經(jīng)門靜脈移植Feridex標記的HMSCs在大鼠肝內(nèi)的存活情況及示蹤 使用CCl4及植物油配置成4：6溶液，按大鼠體重每100g使用0.3ml混合溶液計算，對實驗大鼠進行背部皮下多點注射，首

6、劑加倍，每周2次，共8周；HE染色證明大鼠肝纖維化模型建立成功。用終濃度為25ug/ml的Feridex體外標記第3～6代HMSCs，通過門靜脈途徑移植入大鼠體內(nèi)，同時建立空白對照組；分別于移植后1天、1周、2周、3周及4周時，取肝組織進行免疫組化檢測及組織鐵染色，觀察隨時間推移，移植的HMSCs在大鼠肝臟遷移存活情況。 結果顯示利用CCl4皮下注射方法，持續(xù)8周后，大鼠逐漸消瘦，毛發(fā)無光澤，稀少，肝臟邊緣變鈍、萎縮，質(zhì)地變硬，

7、肝表面出現(xiàn)顆粒狀改變。石蠟切片HE染色可見肝細胞條索紊亂，并出現(xiàn)脂肪樣空泡及假小葉形成。Feridex標記的HMSCs在經(jīng)門靜脈移植后1天后，大鼠肝組織切片可見普魯士藍染色陽性細胞主要沿匯管區(qū)及其周圍肝竇分布；移植后1周大鼠肝組織中，在增生的纖維組織及肝小葉中可見普魯士蘭染色陽性細胞；移植后2周的大鼠肝組織中，小葉內(nèi)普魯士藍染色陽性細胞較前增多；移植后3周肝組織普魯士藍染色，提示增生的纖維組織及小葉中陽性細胞逐漸減少；移植后4周的肝組織

8、，已很難見到有藍染顆粒的細胞存在?？瞻捉M中各時間點均未發(fā)現(xiàn)普魯士藍染色陽性細胞。HMSCs移植后第1天的肝臟組織中免疫組化陽性細胞主要分布于肝內(nèi)匯管區(qū)及匯管區(qū)周圍的肝竇中；移植后1周，肝組織免疫組化陽性細胞仍較多分布于匯管區(qū)，并出現(xiàn)于增生的纖維組織及肝小葉中；移植后2周，小葉內(nèi)免疫組化陽性細胞較前增多；移植后第3～4周，組織切片提示免疫組化陽性細胞在增生的纖維組織及肝小葉中未見減少。而空白組各個時間跨度的肝臟組織切片中，均未發(fā)現(xiàn)免疫組化