肝癌干細(xì)胞新型培養(yǎng)體系的建立以及治療靶點篩選.pdf

1、腫瘤干細(xì)胞的存在已經(jīng)被越來越多的人所認(rèn)同，但由于分離到的CSCs細(xì)胞數(shù)量太少，難以支持后續(xù)實驗的開展。如何在體外有效的分離，培養(yǎng)，擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞，并以此為研究對象是我們思考的方向。國外學(xué)者在長期研究中發(fā)現(xiàn)，加入EGF和bFGF的無血清培養(yǎng)液有利于正常成體干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并維持干細(xì)胞多向分化潛能。目前已經(jīng)在乳腺癌、惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中分離培養(yǎng)得到了類似腫瘤干細(xì)胞的一群細(xì)胞，他們是用含有EGF和bFGF的無血清培養(yǎng)體系維持

2、增殖、分化潛能。我們將以此為基礎(chǔ)進(jìn)行肝癌干細(xì)胞的培養(yǎng)。由于現(xiàn)階段分離肝癌干細(xì)胞還缺乏廣譜的公認(rèn)的標(biāo)志物，且絕大多數(shù)分離工作均局限于肝癌細(xì)胞系，直接從人癌組織分離并培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞尚無報道，嚴(yán)重阻礙了對肝癌干細(xì)胞的深入研究。
　　 本實驗采用直接無血清培養(yǎng)的方法，從肝癌細(xì)胞株以及人原代肝癌組織中分離出肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞并連續(xù)傳代并嘗試建立一種可有效富集肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的體外無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)，以期建立一種從人肝癌組織中分離培養(yǎng)獲得腫瘤

3、干細(xì)胞樣細(xì)胞的新方法。并對培養(yǎng)出的球狀細(xì)胞進(jìn)行體外侵襲性，細(xì)胞周期的變化，細(xì)胞耐藥性，克隆細(xì)胞的體外分化能力以及成瘤能力等方面驗證我們獲得的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性；進(jìn)一步進(jìn)行RNA深度測序和生物信息學(xué)分析，檢測肝癌干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間的差異。
　　 1、人肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的新型培養(yǎng)基的篩選及腫瘤細(xì)胞系的建立
　　 為更好的培養(yǎng)擴(kuò)增肝癌干細(xì)胞，我們對培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過實驗室長期的實驗探索，篩選出7種有效的培養(yǎng)體系。培養(yǎng)

4、成分包括DMEM-F12，非必需氨基酸，血清替代物，N2，B27，B27-minusVA，BSA，EGF，bFGF以及我們自己篩選的2個細(xì)胞因子IGF-1和FGF-10。通過長期的篩選實驗證實C3號培養(yǎng)配方是我們的最佳培養(yǎng)體系。這個配方包含了B27-minusVA，EGF和我們篩選的IGF-1和FGF-10。
　　 利用無血清C3培養(yǎng)基對肝癌細(xì)胞系、原代細(xì)胞系及異種移植技術(shù)得到的腫瘤組織等多種來源的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并獲得了球狀細(xì)胞

5、。從肝癌細(xì)胞系Hep3B和Huh7中培養(yǎng)出來的球狀細(xì)胞Hep3B-C、Huh7-C克隆形態(tài)越來越明顯，并且能夠穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。從高侵襲性的細(xì)胞株HCCLM3和MHCC97-H及低侵襲能力的細(xì)胞株MHCC97-L分別培養(yǎng)得到了HCCLM3-C、MHCC97-H-C和MHCC97-L-C。在肝癌細(xì)胞系中成功得到球狀生長的細(xì)胞之后，我們?nèi)〔∪说哪[瘤組織直接進(jìn)行消化培養(yǎng)，同樣獲得了球狀細(xì)胞EHBH-HCSC-1和EHBF-HCSC-2細(xì)胞。同時，

6、采用了異種移植技術(shù)，將病人的腫瘤組織直接包埋于小鼠皮下，一段時間后取小鼠的皮下腫瘤組織消化培養(yǎng)，分別利用常規(guī)的DMEM-F12+10％FBS和C3無血清培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，得到了一株呈上皮狀生長的腫瘤細(xì)胞系EHBH-3和球狀細(xì)胞EHBH-HCSC-3。
　　 2、球狀細(xì)胞生物學(xué)特性分析
　　 經(jīng)C3無血清培養(yǎng)體系獲得了球狀細(xì)胞后，進(jìn)一步對這些細(xì)胞進(jìn)行了生物學(xué)特性的分析：
　　 1)利用實時熒光定量PCR檢測Wnt-

7、1，CD90,Ep-CAM，NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3在Hep3B、Huh7、MHCC97-L、HCCLM3、Hep3B-C、Huh7-C、MHCC97-L-C、HCCLM3-C中的表達(dá)情況。結(jié)果表明CD90在球狀細(xì)胞中表達(dá)量都高于其相對應(yīng)的貼壁肝癌細(xì)胞株。其中，Huh7-C中CD90的表達(dá)量是Huh7中表達(dá)量的10倍。球狀細(xì)胞與相對應(yīng)的細(xì)胞株相比NOTCH的mRNA表達(dá)均下降，而在Wnt-1和Ep-CAM的mRNA表達(dá)水

8、平上出現(xiàn)了不一致的現(xiàn)象。
　　 2)對球狀細(xì)胞進(jìn)行糖原染色以及ICG的攝取實驗，證實了這些細(xì)胞確實是肝癌細(xì)胞來源的細(xì)胞，而不是其他細(xì)胞污染。
　　 3)利用體外Matrigel侵襲實驗直接比較Huh7細(xì)胞與Huh7-C細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)球狀細(xì)胞Huh7-C與對應(yīng)的Huh7細(xì)胞都具有較強(qiáng)的侵襲特性。定量分析結(jié)果表明，球狀細(xì)胞Huh7-C的侵襲程度比Huh7高接近3倍。
　　 4)通過細(xì)胞周期的分析發(fā)現(xiàn)球狀細(xì)胞

9、Hep3B-C和Huh7-C主要處于G0-G1期，所占的百分比分別為74.09％和.59.20％，與肝癌細(xì)胞株Hep3B和Huh7具有顯著差異。
　　 5)流式細(xì)胞儀和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在球狀細(xì)胞中CD90的表達(dá)量均有不同程度的提高，兩次實驗結(jié)果趨勢一致。在Hep3B-C細(xì)胞中，其提高倍數(shù)達(dá)10倍以上，這與之前的研究者所獲得的肝癌干細(xì)胞的表型一致。同時檢測了細(xì)胞的表面抗原Ep-CAM的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種球狀細(xì)胞的表達(dá)量都是

10、下降的，這與以前的研究是相悖的。
　　 6)在Hep3B-C和Huh7-C細(xì)胞對阿霉素的攝取檢測實驗中發(fā)現(xiàn)，與相對應(yīng)的Hep3B和Huh7相比較，在相同時間里面，球狀細(xì)胞攝入的阿霉素的量少于普通的貼壁肝癌細(xì)胞，這是細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的一個重要的條件。進(jìn)一步檢測細(xì)胞在不同的藥物濃度下的存活率實驗中證實，球狀細(xì)胞Huh7-C相對于貼壁的肝癌細(xì)胞Huh7具有良好的耐藥性。球狀細(xì)胞對臨床證實的第一個針對肝癌靶向性的藥物索拉非尼的耐藥性實驗中

11、也證實了這一點：應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的球狀細(xì)胞在40umol/L的sorafinib的濃度下48小時依然有46％的細(xì)胞存活，而與此相對照的貼壁肝癌細(xì)胞Huh7基本沒有細(xì)胞存活。耐藥性實驗證明，通過無血清條件培養(yǎng)獲得的球狀細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比具有良好的耐藥性。
　　 7)ELISA定量檢測結(jié)果說明無論是貼壁的肝癌干細(xì)胞還是球狀的肝癌細(xì)胞均可以大量表達(dá)VEGF，而不同的細(xì)胞所形成的球狀的細(xì)胞中其表達(dá)趨勢并不是一致的，這可能與很多因

12、素有關(guān)。
　　 8)對獲得的球狀細(xì)胞的進(jìn)一步進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。分別選取肝癌細(xì)胞的標(biāo)記CK8、CK18；膽管細(xì)胞的標(biāo)記CK19；血管細(xì)胞的標(biāo)記Tie2。Huh7表達(dá)CK8和CK18，但不表達(dá)CK19和Tie2，而Huh7-C細(xì)胞對這4個標(biāo)記表達(dá)很弱或不表達(dá)。將Huh7-C誘導(dǎo)后細(xì)胞均表達(dá)這4個標(biāo)記因子。這個結(jié)果提示我們可能球狀細(xì)胞具有多向分化的潛能，可以形成各種不同類型的細(xì)胞，這需要我們找到誘導(dǎo)的最佳條件，從而真正能夠了解這些懸浮

13、、球狀生長的細(xì)胞。
　　 9)本課題通過給NOD/SCID鼠背部皮下注射不同細(xì)胞數(shù)量的肝癌貼壁細(xì)胞與球狀生長的細(xì)胞，比較球狀細(xì)胞與貼壁細(xì)胞的成瘤能力。異種移植成瘤試驗的結(jié)果顯示：接種100個MHCC97-L-C細(xì)胞到NOD/SCID小鼠中可以100％形成腫瘤；1000個HCCLM3-C細(xì)胞接種成瘤率高達(dá)100％；而對應(yīng)的貼壁細(xì)胞成瘤率卻很低。在MHCC97-H-C細(xì)胞株成瘤實驗中發(fā)現(xiàn)100個細(xì)胞就可以在NOD/SCID鼠皮下成瘤

14、，10000個MHCC97-H-C細(xì)胞在小鼠中成瘤率可達(dá)到100％，而相同數(shù)量的貼壁細(xì)胞MHCC97-H卻不能形成腫瘤。小鼠皮下注射105個Huh7細(xì)胞都不能形成腫瘤，但是105個球狀細(xì)胞Huh7-C能100％形成腫瘤。
　　 通過以上實驗結(jié)果證實經(jīng)C3無血清培養(yǎng)體系獲得的球狀細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性，可以作為肝癌干細(xì)胞研究的對象。
　　 3、肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的深度測序以及生物信息學(xué)分析
　　 采用Illumin

15、aHiSeqTM2000測序技術(shù)分別對3株肝癌干細(xì)胞株樣品Huh7-C，Hep3B-C，MHCC97-H-C以及對應(yīng)的3株肝癌細(xì)胞株樣品Huh7，Hep3B，MHCC97-H進(jìn)行RNA深度測序，采用RPKM算法對原始RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，消除系統(tǒng)誤差；采用倍數(shù)法(FoldChange)篩選差異表達(dá)基因，通過文本挖掘進(jìn)一步篩選到44個肝癌干細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵基因，采用Onto-Express軟件將篩選到的基因映射到GeneOntology

16、數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行功能富集性分析。并進(jìn)一步在通路水平上進(jìn)行的富集性分析，將篩選后得到的基因分別映射到GeneGO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫中，基于KEGG數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果僅篩選到了1條關(guān)鍵通路，滿足統(tǒng)計學(xué)檢測指標(biāo)p-value<0.05，基于GeneGO數(shù)據(jù)的分析中則篩選到了17肝癌干細(xì)胞相關(guān)的通路(p-value<0.05)，其中補(bǔ)體通路被2個數(shù)據(jù)庫同時篩選到，可能在肝癌干細(xì)胞的分子過程中起著關(guān)鍵的作用。
　　 另外，本文分別對2株肝

17、癌細(xì)胞系Hep3B，Huh7和2株肝癌干細(xì)胞系Hep3B-C，Huh7-C進(jìn)行了sRNA深度測序，采用SOAP軟件將sRNA定位到基因組上，分析sRNA在基因組上的表達(dá)和分布情況；將4個樣品中的小RNA片段和已知的miRNA、重復(fù)序列、Genbank、Rfam、外顯子和內(nèi)含子、piRNA信息進(jìn)行比對和注釋；采用倍數(shù)法篩選在肝癌干細(xì)胞系與肝癌細(xì)胞系中表達(dá)發(fā)生變化的sRNA，利用泊松分布計算p-value值，并用Benjamini多重假設(shè)檢

18、驗校正p-value值；共篩選到4個repeat片段在Hep3B和Hep3B-C、Huh7和Huh7-C中均差異表達(dá)，37個高表達(dá)、9個低表達(dá)的piRNA以及18個在Hep3B-C/Hep3B，Huh7-C/Huh7中表達(dá)同增同減的miRNA，其中高表達(dá)的miRNA有9個，低表達(dá)的有9個，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p-value<0.01，q-value<0.01)。
　　 通過生物信息學(xué)分析我們得到了很多差異表達(dá)的基因，接下來的任務(wù)任重