rBTI的內(nèi)化及誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑廣泛分布于自然界中，以不同形式存在于植物，動物及微生物體內(nèi)，是一類可以作用于蛋白酶，并對酶有特異性抑制作用的小分子物質(zhì)或蛋白質(zhì)。它們按一定比例與酶結(jié)合形成可逆的蛋白質(zhì)復(fù)合物，在血液凝固，補體級聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞凋亡的調(diào)控以及激素加工處理等過程中發(fā)揮重要的作用。蕎麥胰蛋白酶抑制劑(Buckwheat Trypsin Inhibitor, BTI)是由69個氨基酸組成的分子量為7.9kD的耐熱小分子蛋白，屬于PotatoⅠ型蛋白酶抑制

2、劑家族。本課題組的前期研究表明，重組的蕎麥胰蛋白酶抑制劑(recombinant Buckwheat Trypsin Inhibitor,rBTI)，對Hep G2，EC9706，K562，HL60等腫瘤細(xì)胞株都有明顯的抑制生長并誘導(dǎo)其凋亡的作用，而對正常肝細(xì)胞HL7702沒有影響;rBTI可以誘導(dǎo)促凋亡基因表達上調(diào)，抗凋亡基因表達下降，可以使EC9706細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，但是具體的分子機制還不清楚。
　　本研究選用pE

3、xSecⅠ表達載體，構(gòu)建了含有BTI基因的表達質(zhì)粒pExSecI-BTI，經(jīng)原核表達和純化，獲得了無融合標(biāo)簽的rBTI，分析了rBTI內(nèi)化進入Hep G2細(xì)胞的機制，探討了其誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞自噬的分子機制，以及與細(xì)胞表面的可能受體uPA的相互作用。主要結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了原核表達載體pExSecⅠ-BTI，并對其表達條件進行了優(yōu)化，當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)時間為3.5h時，rBTI的表達量最高。根

4、據(jù)rBTI熱穩(wěn)定性好的特點，對rBTI的純化條件進行了優(yōu)化（80℃熱處理20min），經(jīng)ResourceTMQ離子交換層析一步純化即可獲得純度大于95％的rBTI。這一純化步驟應(yīng)用于rBTI的大規(guī)模制備亦十分有效。
　　2.將rBTI用FITC標(biāo)記，綜合運用多種內(nèi)吞抑制劑及方法，如NH4Cl，MDC，K+，蔗糖溶液等，以及RNA干擾，M期阻滯等技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡研究了rBTI進入Hep G2細(xì)胞的方式。提出rBTI以細(xì)胞膜上尿

5、激酶型纖溶酶原激活子(uPA)為受體，通過網(wǎng)格蛋白依賴性的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞，呈現(xiàn)濃度和能量依賴性，其中細(xì)胞膜電位在內(nèi)吞過程中起著重要作用。
　　3.采用透射電子顯微鏡，MDC染色，流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)研究了rBTI誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞自噬。rBTI作用Hep G2細(xì)胞后，透射電子顯微鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)自噬體以及自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞發(fā)生了自噬，細(xì)胞的自噬活性與rBTI的濃度呈正相關(guān)。通過MDC染色以及pCMV-GFP-LC3轉(zhuǎn)染實驗

6、，進一步確定了rBTI可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，當(dāng)rBTI誘導(dǎo)4h后，Hep G2細(xì)胞即發(fā)生明顯的自噬現(xiàn)象。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察了rBTI作用前后胞內(nèi)細(xì)胞器的變化。在rBTI作用12h后，Hep G2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體發(fā)生較大的變化，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，但是細(xì)胞核的變化不明顯。通過自噬抑制劑3-MA的聯(lián)合使用以及細(xì)胞恢復(fù)實驗等方法，明確了rBTI誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要是自噬性程序性細(xì)胞死亡。
　　4.構(gòu)建了pEGFP-N1-BT

7、I單色熒光載體及pDsRed1-N1-EGFP-BTI雙色熒光載體，觀察了rBTI在Hep G2細(xì)胞內(nèi)的定位，確定了rBTI主要定位于胞質(zhì)中的自噬體及自噬溶酶體。據(jù)此我們提出假說:作為外源物的rBTI被細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)分子選擇性識別，進入自噬溶酶體被降解，過度的自噬誘發(fā)細(xì)胞失去固有的穩(wěn)態(tài)，進而走向死亡。即rBTI介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種底物特異性的死亡機制。通過RT-PCR的方法，對rBTI作用后三個自噬相關(guān)分子（mTOR，Beclin1和

8、PI3KⅢ）進行了RNA水平的分析，結(jié)合3-MA抑制劑實驗，初步確定rBTI誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬主要受Beclin1復(fù)合物的調(diào)控。
　　5.通過熒光光譜法、凝膠電泳法等，進一步確定了rBTI與uPA之間存在相互作用。在體外條件下，rBTI可作為uPA的底物，被uPA水解為兩個片段。采用RT-PCR的方法，對rBTI作用后，uPA以及uPA下游兩個分子（MMP-2和MMP-9）進行了檢測，并通過明膠酶譜和細(xì)胞劃痕實驗研究了rBTI對Hep