C5a-C5aR信號在紅內(nèi)期全蟲疫苗誘導(dǎo)免疫性保護中的作用和機制研究.pdf

1、瘧疾是一類嚴重危害人類健康的熱帶傳染性疾病，在全球有著很高的發(fā)病率和致死率，而紅內(nèi)期疫苗是瘧疾防治中最經(jīng)濟有效的方式之一。雖然全世界科學(xué)家付出了極大的努力，但到目前為止，仍然沒有一種有效的紅內(nèi)期亞單位疫苗問世。目前紅內(nèi)期亞單位疫苗存在的主要問題在于瘧原蟲抗原的高變異性及裂殖子表面蛋白的多態(tài)性。最近，紅內(nèi)期全蟲疫苗被證實它能夠保護宿主抵抗多種瘧原蟲攻擊，而且其保護作用主要由CD4+T細胞所介導(dǎo)，這也許能為紅內(nèi)期亞單位疫苗的設(shè)計提供一種新的

2、策略。然而，紅內(nèi)期全蟲疫苗中瘧原蟲特異性CD4+T細胞活化的具體機制仍然很不清楚。
　　 補體作為天然免疫系統(tǒng)十分重要的組成部分，最近的研究表明，補體在適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮著不可替代的作用。比如，補體C5a通過調(diào)節(jié)DC功能間接影響CD8+T細胞活化。然而，C5a在全蟲疫苗誘導(dǎo)CD4+T細胞反應(yīng)中的作用還不清楚。
　　 在本研究中，我們首先觀察紅內(nèi)期全蟲疫苗免疫后，WT和C5aR-/-小鼠體內(nèi)補體活化及C5a產(chǎn)生情況

3、，并確認C5a/C5aR信號是否在紅內(nèi)期全蟲疫苗中發(fā)揮作用。然后我們檢測兩種小鼠免疫后體內(nèi)抗體及CD4+T細胞功能是否發(fā)生改變，并采用過繼轉(zhuǎn)移實驗證實是抗體還是CD4+T細胞參與免疫保護過程。最后，我們檢測兩種免疫小鼠脾臟Treg頻率及DC功能，找到影響C5aR-/-免疫小鼠CD4+T細胞功能下降的主要原因。
　　 一、C5aR缺失顯著降低全蟲疫苗誘導(dǎo)小鼠的保護性免疫力
　　 1.觀察全蟲疫苗免疫后，WT小鼠和C5aR-

4、/-小鼠體內(nèi)補體活化及C5a產(chǎn)生情況：與未免疫的正常小鼠相比，兩種免疫小鼠血清C5a含量均升高。在免疫后第二天，其濃度達到最高峰，且兩種小鼠血清C5a濃度變化趨勢基本一致。
　　 2.C5aR-/-降低小鼠紅內(nèi)期全蟲疫苗的保護性：末次免疫后兩周，用p.y17XL pRBC攻擊免疫小鼠，觀察小鼠的原蟲血癥及存活率，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，兩種免疫小鼠均具有免疫保護作用。但是，C5aR-/-免疫小鼠免疫保護效果明顯低于WT免疫小鼠。這說

5、明紅內(nèi)期全蟲免疫能夠提供免疫保護作用，而C5a/C5aR信號在其中發(fā)揮著重要的作用。
　　 二、C5aR缺失影響DC活化CD4+T細胞功能，從而降低全蟲疫苗誘導(dǎo)小鼠保護力
　　 1.抗體不能為紅內(nèi)期全蟲疫苗提供保護：分離末次免疫后兩周小鼠的血清，進行瘧原蟲特異性抗體檢測，發(fā)現(xiàn)兩種小鼠血清IgG與IgG2a滴度相同。雖然WT免疫小鼠IgG1滴度比C5aR-/-免疫小鼠高一個數(shù)量級，但兩者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。將兩種小鼠的血清

6、過繼轉(zhuǎn)移至正常未免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)并不能保護小鼠抵抗瘧原蟲的攻擊，說明抗體不能為紅內(nèi)期全蟲疫苗提供保護。
　　 2.C5aR-/-小鼠CD4+T細胞的功能及記憶性T細胞的形成受到明顯抑制：分離末次免疫后兩周小鼠脾臟淋巴細胞，觀察瘧原蟲特異性CD4+T細胞增殖、IFN-γ分泌及記憶性T細胞的形成情況，發(fā)現(xiàn)免疫后敲除小鼠的脾臟瘧原蟲特異性CD4+T細胞增殖及IFN-γ分泌能力均弱于WT小鼠，且記憶性CD4+T細胞的形成受到明顯抑制。

7、r>　　 3.CD4+T細胞功能及記憶性T細胞形成缺陷是C5aR缺失小鼠保護力下降的重要原因：分離末次免疫后兩周脾臟CD4+T細胞，將其過繼轉(zhuǎn)移至正常未免疫小鼠。在用P.y17XL pRBC攻擊后發(fā)現(xiàn)，免疫后的WT小鼠脾臟CD4+T細胞能夠提供完全性保護作用，而敲除小鼠過繼轉(zhuǎn)移組小鼠最后全部死亡，說明紅內(nèi)期全蟲疫苗的保護效果主要是由CD4+T細胞提供，而且C5aR-/-小鼠保護力下降的重要原因在于CD4+T細胞功能及記憶性T細胞形成缺

8、陷。
　　 4.Treg可能不影響C5aR-/-免疫小鼠CD4+T細胞的功能：分離末次免疫后兩周小鼠脾臟淋巴細胞，檢測Treg頻率的變化，發(fā)現(xiàn)C5aR-/-免疫小鼠脾臟淋巴細胞Treg頻率略高于WT免疫小鼠，但兩者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明Treg可能不影響C5aR缺失免疫小鼠CD4+T細胞的功能。
　　 5.C5aR缺失免疫小鼠脾臟DC功能顯著下降：分離初次免疫后2、4、6天小鼠脾臟DC，檢測其表面共刺激分子表達及刺激活

9、化T細胞能力，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠DC共刺激分子CD86、MHc-Ⅱ分子表達水平以及刺激活化T細胞能力均顯著低于WT免疫小鼠，這說明C5aR缺失能夠影響紅內(nèi)期全蟲疫苗誘導(dǎo)小鼠DC的成熟，進而影響CD4+T細胞的功能。
　　 6.C5a和P.y17X裂解產(chǎn)物單獨或聯(lián)合刺激均不能直接誘導(dǎo)DC的成熟：將BMDC與C5a、P.y17XL、C5a+P.y17XL分別進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)C5a和P.y17XL單獨或聯(lián)合刺激均不能誘導(dǎo)DC表面共刺激分子C

10、D86、CD40、MHc-Ⅱ分子上調(diào)，提示C5a/C5aR信號可能不是通過直接作用的方式影響全蟲疫苗誘導(dǎo)DC成熟。
　　 本研究成功建立了紅內(nèi)期全蟲疫苗模型，利用該模型我們發(fā)現(xiàn)C5a/C5aR信號通過影響瘧原蟲特異性CD4+T細胞功能，從而在紅內(nèi)期全蟲疫苗中發(fā)揮重要作用，而這一作用與DC功能的改變密切相關(guān)。本研究首次證實了C5a/C5aR信號是紅內(nèi)期全蟲疫苗有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護性免疫所必需的，一定程度上揭示了紅內(nèi)期全蟲疫苗瘧原蟲