不同分子量黃原膠的制備、分析及其預(yù)防大鼠術(shù)后腹腔粘連的研究.pdf

1、黃原膠(xanthan gum)是由甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的一種細(xì)胞外雜多糖，相對(duì)分子質(zhì)量（relative molecular weight，Mr）分布范圍為2×106-2×107，具有高穩(wěn)定性、假塑流變性、增稠性、懸浮性和乳化性以及安全性的特點(diǎn)。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，黃原膠主要用作藥用輔料。黃原膠本身具有的特殊理化性能使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有較大開發(fā)潛力。目前已建立適合工業(yè)化生產(chǎn)的注射用黃原膠原

2、料藥制備工藝，制定了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，已進(jìn)行對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎的療效和作用機(jī)制的研究。根據(jù)黃原膠高M(jìn)r、高黏彈性和高穩(wěn)定性的性質(zhì)，在術(shù)后防粘連等領(lǐng)域中還可有應(yīng)用。Mr是表征黃原膠特性的基本參數(shù)之一，也是工業(yè)生產(chǎn)中質(zhì)量檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。不同Mr的黃原膠表現(xiàn)出不同的理化特性，其用途也不同。黃原膠的高穩(wěn)定性、高黏彈性等特性與其Mr密切相關(guān)，Mr越大，黃原膠溶液的黏度越高，黏彈性越好。因此，宜加大對(duì)高M(jìn)r黃原膠的生產(chǎn)、開發(fā)力度，進(jìn)一步拓展黃原膠在醫(yī)藥

3、領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。本課題通過優(yōu)化發(fā)酵工藝進(jìn)一步提高了黃原膠的Mr;制備了不同Mr的黃原膠，運(yùn)用近紅外光譜分析技術(shù)（near-infrared spectroscopy，NIRS）建立了黃原膠Mr的定量分析模型，實(shí)現(xiàn)了黃原膠Mr的快速測(cè)定;考察了不同Mr黃原膠對(duì)大鼠術(shù)后腹腔粘連的預(yù)防效果。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：高M(jìn)r黃原膠的發(fā)酵優(yōu)化。
　　目的：通過發(fā)酵優(yōu)化獲得高M(jìn)r的黃原膠，建立高M(jìn)r黃原膠的發(fā)酵工藝。
　

4、　方法：使用搖瓶發(fā)酵，以黃原膠粗品溶液的黏度為考察指標(biāo)，通過對(duì)發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間等條件以及氮源、碳源等培養(yǎng)基組成的考察，確定培養(yǎng)條件。隨后進(jìn)行10L發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定最終發(fā)酵工藝條件，并進(jìn)行了50L規(guī)模的中試放大。黃原膠精制品Mr的測(cè)定采用體積排阻色譜結(jié)合多角度激光散射法(size exclusion chromatography combined with multi-angle laser light scatter

5、ing,SEC-MALLS)，為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，測(cè)定了黃原膠精制品的dn/dc值。
　　結(jié)果：優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及工業(yè)化發(fā)酵工藝條件為:葡萄糖4％，豆餅粉0.3％，酵母粉0.05％，檸檬酸0.1％，硫酸鎂0.01％，碳酸鈣0.4％，接種量4％，溫度28℃，發(fā)酵72 h，pH=7.0。采用補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，葡萄糖初始濃度2％，在第42 h一次性補(bǔ)加2％的葡萄糖。測(cè)得黃原膠分子在NaCl溶液中的dn/dc值為0.163。發(fā)酵優(yōu)化

6、后黃原膠的Mr為6.91×106，較優(yōu)化前Mr提高了30.4％。
　　結(jié)論：確定了高M(jìn)r黃原膠的工業(yè)化發(fā)酵工藝，篩選到了高M(jìn)r的黃原膠。
　　第二部分：基于近紅外光譜技術(shù)的黃原膠Mr快速檢測(cè)研究。
　　目的：采用NIRS結(jié)合偏最小二乘(partial least square，PLS)算法，建立一種快速檢測(cè)黃原膠Mr的方法。
　　方法：采用超聲降解法制備了一組具有一定Mr梯度的粉末狀黃原膠樣品，樣品標(biāo)準(zhǔn)Mr的測(cè)定

7、采用SEC-MALLS法。采集樣品的近紅外光譜并與SEC-MALLS測(cè)得的Mr數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，采用主成分分析法對(duì)樣品集進(jìn)行劃分，建立黃原膠Mr的NIRS分析模型。建模過程中，對(duì)光譜預(yù)處理方法和建模光譜區(qū)間進(jìn)行選擇和優(yōu)化，并對(duì)比了兩種采樣方式，即積分球采樣模塊和光纖采樣模塊對(duì)建模效果的影響。
　　結(jié)果：兩種采樣方式均能實(shí)現(xiàn)黃原膠Mr的定量分析，而使用光纖采樣模塊采樣的建模效果要優(yōu)于使用積分球采樣模塊。最終，使用光纖模式采集光譜以獲得最

8、佳的模型效果，選取多元散射校正和均值中心化作為最佳的光譜預(yù)處理方法，在4000-4900 cm-1、5465-7100 cm-1和7345-8240 cm-1的光譜范圍內(nèi)建立黃原膠Mr的NIRS定量分析模型。該模型的校正集決定系數(shù)(R2c)、驗(yàn)證集決定系數(shù)（R2p）、剩余預(yù)測(cè)偏差(RPD)和預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)分別為0.967、0.975、6.028和0.250×106。采用最佳PLS模型，從Mr檢測(cè)范圍、模型的線性、方法的準(zhǔn)確

9、度以及精密度等方面，對(duì)黃原膠Mr的NIRS分析方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，在Mr為0.844×106-5.962×106的范圍內(nèi)具有良好的線性，R2=0.969，驗(yàn)證集樣品的NIRS預(yù)測(cè)值與SEC-MALLS測(cè)定值之間無顯著性差異，重復(fù)性和中間精密度考察的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5％，測(cè)量的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足黃原膠Mr的實(shí)際檢測(cè)要求。從樣品及樣品制備方法、采樣方式和樣品含水量3個(gè)方面探討了運(yùn)用NIRS技術(shù)檢測(cè)黃原膠Mr的影響因素，發(fā)現(xiàn)樣

10、品的含水量是最主要的影響因素。在此基礎(chǔ)上，提出了該方法在實(shí)際運(yùn)用中所應(yīng)注意的操作規(guī)程，即:控制樣品的含水量，選擇光纖模式采譜，防止樣品吸濕，盡量縮短光譜的采集時(shí)間，以減少樣品含水量對(duì)該方法造成的影響。
　　結(jié)論：該方法簡單、實(shí)用，實(shí)現(xiàn)了黃原膠Mr的快速測(cè)定，其準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足實(shí)際檢測(cè)要求，有望成為一種黃原膠生產(chǎn)過程中快速檢測(cè)Mr的方法，可以作為質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)，在工廠中實(shí)現(xiàn)對(duì)黃原膠Mr的在線分析。
　　第三部分：黃原膠預(yù)防大

11、鼠術(shù)后腹腔粘連的實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：考察不同濃度及不同Mr黃原膠預(yù)防大鼠術(shù)后腹腔粘連的效果，評(píng)價(jià)腹腔注射黃原膠的安全性。
　　方法：手術(shù)造大鼠腹腔粘連模型后，在盲腸與腹壁受損部位分別噴涂0.5％、1％和2％(w/v)的黃原膠注射液、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(1.2％)或生理鹽水各1 mL。7d后取樣，觀察動(dòng)物整體及局部反應(yīng)，檢測(cè)血液學(xué)及血液生化指標(biāo)，觀察心、肝、腎組織病理學(xué)變化并評(píng)價(jià)防粘連效果。使用Mr分別為6.91×106、4

12、.75×106和2.51×106的黃原膠制備1％的黃原膠注射液。手術(shù)造模后，在受損部位噴涂不同Mr黃原膠注射液、透明質(zhì)酸鈉凝膠或生理鹽水各1 mL。7d后取樣，評(píng)價(jià)不同Mr黃原膠腹腔注射的安全性及防粘連作用效果。使用旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)比了不同Mr黃原膠注射液的流變學(xué)特性。
　　結(jié)果：與生理鹽水組相比，不同濃度及不同Mr黃原膠組大鼠體重、血液學(xué)及血液生化指標(biāo)等均無明顯改變（P＞0.05）;心、肝、腎組織未見明顯病理改變。與生理鹽水組相比，

13、噴涂黃原膠后，腹腔粘連的發(fā)生率和嚴(yán)重程度明顯降低（P＜0.05）。黃原膠的濃度越高，防粘連效果越好。1％高M(jìn)r黃原膠的防粘連效果優(yōu)于低Mr黃原膠。與1.2％醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠相比，高M(jìn)r的黃原膠在低剪切速率下具有更高的黏度和凝膠硬度。
　　結(jié)論：在大鼠腹腔噴涂不同濃度(0.5％～2％)及不同Mr的黃原膠1 mL，全身及局部未見明顯毒性作用。黃原膠能夠顯著降低模型動(dòng)物術(shù)后腹腔粘連的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。1％高M(jìn)r黃原膠的防粘連效果顯著優(yōu)