影響人早期胚胎發(fā)育的卵丘細(xì)胞中mRNA-lncRNA表達(dá)譜的研究.pdf

1、第一部分影響早期胚胎發(fā)育的卵丘細(xì)胞中mRNA表達(dá)譜的研究
　　【目的】本實(shí)驗(yàn)采用Arraystar human mRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)人MⅡ卵母細(xì)胞周?chē)亚鸺?xì)胞中對(duì)影響早期胚胎發(fā)育的 mRNAs表達(dá)水平，并對(duì)差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行篩選分析和驗(yàn)證。
　　【方法】
　　1.收集在我中心接受IVF-ET治療的患者的卵丘細(xì)胞，按照胚胎質(zhì)量各自對(duì)應(yīng)分組，發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞為優(yōu)質(zhì)胚胎卵丘細(xì)胞組（A組）,發(fā)

2、育成劣質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞為劣質(zhì)胚胎卵丘細(xì)胞組（B組）。檢測(cè)6個(gè)樣本的RNA總量以保證符合芯片檢測(cè)要求。對(duì)卵丘細(xì)胞樣本中RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得Cy3熒光染料標(biāo)記的aRNA，采用Arraystar Human mRNA V2.0表達(dá)譜芯片（8x60K，Arraystar）檢測(cè)卵丘細(xì)胞樣本中mRNA表達(dá)水平，Agilent Feature Extraction(version11.0.1.1)軟件提取獲得的微陣列圖像原始信號(hào)值，Ge

3、neSpring GX verision12.1軟件包(Agilent Technologies)對(duì)獲取的mRNA原始信號(hào)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并質(zhì)量評(píng)估。
　　2.采用兩分類的差異基因篩選方法對(duì)差異mRNAs進(jìn)行篩選，火山圖和聚類分析圖顯示兩組卵丘細(xì)胞中差異mRNAs表達(dá)情況。應(yīng)用基因富集分析方法進(jìn)一步分析差異表達(dá)的mRNAs，分別進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析。
　　3.差異mRNAs的Real-time PCR驗(yàn)

4、證篩選相關(guān)的mRNAs，挑選目的基因，采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證其表達(dá)水平。
　　【結(jié)果】
　　1.對(duì)接受IVF-ET治療患者中，選取的3例患者6個(gè)樣本的卵丘細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)均符合mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)的要求。其中，A組樣本（4A、5A、7A）中RNA OD260/280比值分別為1.95、1.92、2.04；B組樣本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分別為2.05、2.00、1.94。兩組樣本符合芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求。

5、對(duì)卵丘細(xì)胞樣本中RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并用Cy3熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，特異性標(biāo)記活性為（pmol/μl染料）/(μg/μl cRNA），A組（4A、5A、7A）分別為21.42、21.70、20.64，B組（4B、5B、7B）分別為21.25、21.47、21.00，符合芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求。兩組樣本中共檢測(cè)到mRNA靶基因數(shù)15797個(gè)；過(guò)濾后數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，用箱體圖分析顯示6個(gè)樣本mRNAs表達(dá)水平接近在一個(gè)水平。散點(diǎn)圖分析結(jié)果顯示兩組卵丘細(xì)胞中存

6、在大量差異表達(dá)的mRNAs。
　　2.兩樣本間差異表達(dá)mRNAs的篩選分析，檢測(cè)到差異表達(dá)的mRNAs810個(gè)，其中B組vs A組上調(diào)表達(dá)的mRNAs是91個(gè)，B組vs A組下調(diào)表達(dá)的mRNAs是719個(gè)。對(duì)差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示，B組vs A組上調(diào)表達(dá)的mRNA中，參與生物學(xué)過(guò)程的基因數(shù)是112個(gè)，參與細(xì)胞組成的基因數(shù)是24個(gè)，參與分子功能的基因數(shù)是22個(gè)。在B組vs A組下調(diào)表達(dá)的mRNA中，參與生物學(xué)過(guò)程

7、的基因數(shù)是389個(gè)，參與細(xì)胞組成的基因數(shù)是94個(gè)，參與分子功能的基因數(shù)是85個(gè)。對(duì)差異表達(dá)的mRNAs信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示，B組vs A組上調(diào)表達(dá)的mRNA基因參與了5條信號(hào)通路，下調(diào)表達(dá)的mRNA基因參與了12條信號(hào)通路。
　　3.挑選差異基因RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片表達(dá)結(jié)果一致。
　　【結(jié)論】
　　發(fā)育成不同質(zhì)量卵裂期胚胎的人 MⅡ期卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞間存在大量差異表達(dá)的 m

8、RNAs；GO分析和pathway分析提示卵丘細(xì)胞中這些差異表達(dá)的mRNAs參與了各種生物學(xué)途徑和信號(hào)通路對(duì)早期胚胎發(fā)育的調(diào)控。這些 mRNAs的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，可能進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育和早期胚胎的發(fā)育。
　　第二部分影響早期胚胎發(fā)育的卵丘細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的研究及其與 mRNA關(guān)聯(lián)分析
　　【目的】本實(shí)驗(yàn)采用Arraystar human lncRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)人MⅡ卵母細(xì)胞周?chē)?/p>

9、卵丘細(xì)胞中對(duì)影響早期胚胎發(fā)育的 lncRNAs表達(dá)水平，對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行篩選分析和驗(yàn)證。并將差異表達(dá)的lncRNAs與mRNAs關(guān)聯(lián)分析。
　　【方法】
　　1.收集在我中心接受IVF-ET治療的3名患者的卵丘細(xì)胞，按照胚胎質(zhì)量各自對(duì)應(yīng)分組，發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞為優(yōu)質(zhì)胚胎卵丘細(xì)胞組（A組）,發(fā)育成劣質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞為劣質(zhì)胚胎卵丘細(xì)胞組（B組）。檢測(cè)6個(gè)樣本的RNA總量以保證符合芯

10、片檢測(cè)要求。對(duì)卵丘細(xì)胞樣本中RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得Cy3熒光染料標(biāo)記的aRNA，采用Arraystar Human lncRNA V2.0表達(dá)譜芯片（8x60K，Arraystar）檢測(cè)卵丘細(xì)胞樣本中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平，Agilent Feature Extraction(version11.0.1.1)軟件對(duì)獲得的微陣列圖像提取原始信號(hào)值，GeneSpring GX軟件包(Agilent Technologies，verision12

11、.1)對(duì)獲取的lncRNA原始信號(hào)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并質(zhì)量評(píng)估。
　　2.采用兩分類的差異基因篩選方法對(duì)差異 lncRNAs進(jìn)行篩選，火山圖和聚類分析圖顯示兩組卵丘細(xì)胞中差異lncRNAs表達(dá)情況。根據(jù)lncRNA在染色體上的位置和已知功能分類對(duì)芯片檢測(cè)出來(lái)的差異表達(dá) lncRNA進(jìn)行分類和亞組分析。
　　3.篩選相關(guān)的lncRNAs，挑選目的lncRNAs，采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證其表達(dá)水平。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)比較差異mRNAs和l

12、ncRNAs，試圖尋找出共同表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)的基因。以與卵丘細(xì)胞、早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)為基礎(chǔ)，對(duì)于 PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致的mRNAs和lncRNAs，分別采用CNC網(wǎng)絡(luò)圖分析，建立二者之間的聯(lián)系，并初步構(gòu)建lncRNA與mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　【結(jié)果】
　　1.對(duì)接受IVF-ET治療患者中，選取的3例患者6個(gè)樣本的卵丘細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)均符合 lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)的要求。其中，A組樣本（4A、5A、7A）中RNA OD2

13、60/280比值分別為1.95、1.92、2.04；B組樣本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分別為2.05、2.00、1.94。兩組樣本符合芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)卵丘細(xì)胞樣本中RNA逆轉(zhuǎn)錄并用Cy3熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，特異性標(biāo)記活性為（pmol/μl染料）/(μg/μl cRNA），A組（4A、5A、7A）分別為21.42、21.70、20.64，B組（4B、5B、7B）分別為21.25、21.47、21.00，符合芯片

14、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求。兩組樣本中共檢測(cè)到lncRNA20563個(gè)；過(guò)濾后數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，用箱體圖分析顯示6個(gè)樣本的lncRNAs表達(dá)水平接近在一個(gè)水平。散點(diǎn)圖分析結(jié)果顯示兩組卵丘細(xì)胞中存在大量差異表達(dá)的lncRNAs。
　　2.兩樣本間差異表達(dá)lncRNAs的篩選分析，檢測(cè)到差異表達(dá)的lncRNAs共633個(gè)，其中B組vs A組上調(diào)表達(dá)的lncRNAs是124個(gè)，B組vs A組下調(diào)表達(dá)的lncRNAs是509個(gè)。對(duì)lncRNA亞組分析：發(fā)揮

15、增強(qiáng)子功能的lncRNAs有925個(gè)，增強(qiáng)子附近編碼基因的有166個(gè)；HOX簇序列的lncRANs有387個(gè)；位于基因間的 lncRNA(LincRNAs)有2041個(gè)，LincRNAs附近的編碼基因有373個(gè)。
　　3.部分差異lncRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片表達(dá)結(jié)果一致。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)，篩選比較了差異mRNAs和lncRNAs，篩選出共同表達(dá)的基因分別為：ASNS、CALB2和NEK7，對(duì)應(yīng)的 lncRNAs

16、分別為：ENST00000429197、NR_027910和Y00062。三對(duì)mRNAs/lncRNAs在B組vs A組中均是下調(diào)表達(dá)。
　　【結(jié)論】
　　1.發(fā)育成不同質(zhì)量卵裂期胚胎的人MⅡ期卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞間存在大量差異表達(dá)的lncRNAs，提示了卵丘細(xì)胞中這些差異表達(dá)的lncRNAs可能參與了對(duì)早期胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)制；對(duì)lncRNAs的亞組分析提示有很多不同功能的lncRNAs參與mRNAs的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、表觀