黑曲霉葡萄糖氧化酶基因轉(zhuǎn)化草地早熟禾的研究.pdf

1、草地早熟禾(Poapratensis L)屬冷季型草坪草，是溫帶地區(qū)重要的草種之一。由于它具有色澤美、抗寒能力強(qiáng)、耐蔭、耐修剪等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)北方地區(qū)多被用作建坪草種之一。但草地早熟禾易受多種真菌感染，其病害的發(fā)生和蔓延，輕者可使草坪褪綠、黃化，形成枯死斑塊，影響觀賞和利用價(jià)值；重者可使整塊草坪迅速衰敗，難以利用。因此，培育具有廣譜抗病性能的草地早熟禾新品種具有重要的意義。 本研究以草地早熟禾品種超級(jí)伊克利(Poapratensi

2、s L.cv.Total eclipse)的成熟種子為外植體材料，在對(duì)草地早熟禾轉(zhuǎn)化再生體系進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GO)基因?qū)氩莸卦缡旌?，并由篩選出的卡那霉素抗性愈傷組織分化再生植株。對(duì)所得到的卡那霉素抗性植株進(jìn)行PCR和RT-PCR分析，利用淀粉一碘化鉀反應(yīng)和TiCl<,4>-PAR比色法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的過氧化氫(Hydrogen peroxide,H<,

3、2>O<,2>)，以此來檢測(cè)葡萄糖氧化酶基因的表達(dá)。對(duì)所得到的轉(zhuǎn)基因草地早熟禾植株人工接種冠銹菌夏孢子進(jìn)行抗病性鑒定并測(cè)定了抗病性相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果如下： 1．附加2，4-D 2.0 mg/L和BAP 0.2 mg/L激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是誘導(dǎo)超級(jí)伊克利成熟胚愈傷組織發(fā)生較為適宜的培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)頻率達(dá)30％～43％。附加2，4-D 1.0 mg/L和BAP 0.5 mg/L的愈傷組織繼代培養(yǎng)基是超級(jí)伊克利成熟胚愈傷組織繼代培養(yǎng)

4、適宜的培養(yǎng)基，在愈傷組織分化培養(yǎng)基中附加2.0mg/L BAP或CPPU，經(jīng)繼代培養(yǎng)3代的愈傷組織的綠苗分化率保持在30％左右。 2．PCR檢測(cè)結(jié)果表明外源葡萄糖氧化酶基因已整合到草地早熟禾基因組中， RT-PCR分析結(jié)果表明葡萄糖氧化酶基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄水平得到表達(dá)。H<,2>O<,2>的定性和定量檢測(cè)結(jié)果證實(shí)葡萄糖氧化酶基因在翻譯水平上表達(dá)。 3．人工接種冠銹菌夏孢子后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)冠銹病具有良好的抗性，其抗病性相關(guān)指標(biāo)