促凋亡基因Bax逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及高表達(dá)Bax基因Hela細(xì)胞株的建立.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文促凋亡基因Bax逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及高表達(dá)Bax基因Hela細(xì)胞株的建立姓名：陳秀軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：腫瘤學(xué)（腫瘤放射治療學(xué)）指導(dǎo)教師：程玉峰20040511山東大學(xué)醫(yī)學(xué)碩士論文促凋亡基因Bax逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及高表達(dá)Bax基因Hela細(xì)胞株的建立研究生導(dǎo)師陳秀軍程玉峰副教授摘要目的:克隆促凋亡基因Bax，構(gòu)建Bax基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSNBax轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后建立高表達(dá)Bax基因的Hela細(xì)

2、胞株，旨在探討B(tài)ax基因的表達(dá)與腫瘤放射敏感性之間的關(guān)系，為Bax基因聯(lián)合放射療法治療腫瘤提供理論依據(jù)。方法:1)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的Baxa的基因序列，設(shè)計(jì)特異引物BaxFIR，采用RTPCR方法從Hela細(xì)胞來(lái)源的cDNA克隆Baxa基因序列:2)通過(guò)EcoRl和Xhol限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，將Baxa基因定向克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSN中，采用菌落PCR酶切、測(cè)序等方法篩選和鑒定Bax基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXS

3、NBax3)采用脂質(zhì)體方法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSNBax轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，收集PA317細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的病毒顆粒，此PA317細(xì)胞再經(jīng)G418篩選(終濃度800pgmL)，獲得能穩(wěn)定產(chǎn)生病毒包裝顆粒的PA317細(xì)胞株，用于今后體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。4)用PA317細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)正常培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得抗性克隆后，以基因組PCR及RTPCR半定量分析方法鑒定高表達(dá)Bax基因的Hela

4、細(xì)胞株。結(jié)果:1)采用Baxa的特異引物BaxFIR，從Hela細(xì)胞cDNA中克隆到野生型的Baxa基因序列2)通過(guò)EcoRl和Xhal酶切位點(diǎn)，將Baxa基因定向克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSN中，篩選得到有Bax基因插入的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSNBax3)經(jīng)G418篩選，PCR鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞，建立了高表達(dá)Bax基因的Hela細(xì)胞株。結(jié)論:應(yīng)用RTPCR技術(shù)成功克隆到野生型Baxa基因并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒