溶瘤病毒ZD55-TRAIL對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株的殺傷及聯(lián)合作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分:ZD55-TRAIL對(duì)多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用
　　目的:
　　研究ZD55-TRAIL對(duì)MM細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡情況，從而為進(jìn)一步研究ZD55-TRAIL的抗骨髓瘤凋亡機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　MTT法檢測(cè)ZD55-TRAIL對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)分析ZD55-TRAIL對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株的感染率，Hoechst染色法觀察ZD55-TRAIL誘導(dǎo)MM

2、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，Western-blot法檢測(cè)ZD55-TRAIL作用后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP蛋白的表達(dá)變化，Western-blot法檢測(cè)IGF-1R及其下游NF-κB靶蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　(1)0～40MOI的ZD55-TRAIL分別作用于RPMI8226、MM1S、MM1R細(xì)胞株24小時(shí)之后，IC50約3～78MOI，0～20MOI的ZD55-TRAIL分

3、別作用于RPMI8226、MM1.S、MM1.R細(xì)胞株48小時(shí)之后，IC50約2～6.4MOI。表明骨髓瘤細(xì)胞株包括DXM-敏感和DXM-耐藥的細(xì)胞株對(duì)ZD55-TRAIL均敏感。(2)0～50MOI的ZD55-TRAIL分別作用于RPMI8226細(xì)胞株24h和48h后，在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性增加，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5MOI、25MOI、50MOI時(shí)的GFP表達(dá)率分別為16.8％、52.8％和62.9％。(3)分別以

4、0～10MOI的ZD55和ZD55-TRAIL作用于RPMI8226細(xì)胞株48小時(shí)后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)ZD55-TRAIL具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而ZD55細(xì)胞毒力較小。(4)外源性IL-6(10ng/ml)不能逆轉(zhuǎn)ZD55-TRAIL誘導(dǎo)的RPMI8226凋亡，提示ZD55-TRAIL可以抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)。(5)以16MOI的ZD55-TRAIL作用于RPMI8226細(xì)胞株24h后，與對(duì)照組相比細(xì)胞核內(nèi)可見明顯的凋亡小體

5、，從形態(tài)學(xué)上證明ZD55-TRAIL可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞發(fā)生凋亡。(6)ZD55-TRAIL誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞株凋亡時(shí)，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP激活，Bcl-xl下調(diào)。TRAIL蛋白表達(dá)呈劑量依賴性增加，其死亡受體DR4、DR5無明顯變化。(7)ZD55-TRAIL能夠下調(diào)IGF-1R(mRNA和蛋白水平)及其下游NF-κB靶蛋白，但對(duì)P110a、P110δ影響不大。(8)外源性IGF-1不

6、能夠逆轉(zhuǎn)ZD55-TRAIL對(duì)MM細(xì)胞的殺傷作用和蛋白抑制作用。
　　第二部分:溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL協(xié)同PI3K抑制劑LY294002或蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)MM細(xì)胞株死亡及機(jī)制研究
　　目的:
　　研究溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL協(xié)同LY294002或MG132促進(jìn)MM細(xì)胞的凋亡作用，并探討協(xié)同促凋亡的機(jī)制。
　　方法:
　　通過MTT法檢測(cè)ZD55-TRAIL聯(lián)合PI3K抑制劑或蛋白酶

7、體抑制劑對(duì)MM細(xì)胞株和正常肝臟細(xì)胞株L02的生長(zhǎng)抑制作用，Western-blot法檢測(cè)Caspase-3、PARP，PI3K/Akt/mTOR通路的相關(guān)蛋白表達(dá)情況，集落形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆情況，結(jié)晶紫染色觀察對(duì)正常肝臟細(xì)胞株L02的的殺傷作用，Hoechst染色法觀察聯(lián)合處理對(duì)RPMI8226細(xì)胞株誘導(dǎo)凋亡后的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　(1) MTT結(jié)果顯示溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL與PI3K抑制劑LY29400

8、2具有協(xié)同抑制MM的作用。(2)Western-blot結(jié)果顯示單獨(dú)溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL處理RPMI8226細(xì)胞株后，出現(xiàn)Akt/mTOR通路蛋白的激活。但PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合后能夠增強(qiáng)ZD55-TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，caspase-3、 PARP蛋白激活明顯，且對(duì)Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的靶向抑制作用更明顯。(3)蛋白酶體抑制劑MG132與溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL，MTT結(jié)果顯示有較好的協(xié)同作用，C

9、I＜1。并對(duì)正常肝臟細(xì)胞株L02無抑制。(4)Western-blot顯示較低劑量的MG132和ZD55-TRAIL聯(lián)合即可引起凋亡明顯增強(qiáng)，Caspase3、 Caspase8、Caspase9和PARP激活，TRAIL的死亡受體DR5增強(qiáng)明顯，而DR4激活不明顯。單獨(dú)濃度梯度的MG132也可引起DR5上調(diào)而DR4表達(dá)不變。(5)集落培養(yǎng)進(jìn)一步證實(shí)ZD55-TRAIL與MG132具有協(xié)同抗MM作用。(6)結(jié)晶紫染色證實(shí)MG132和ZD

10、55-TRAIL的聯(lián)合處理對(duì)L02細(xì)胞株無殺傷作用。
　　結(jié)論:
　　骨髓瘤細(xì)胞株包括DXM-敏感和DXM-耐藥的細(xì)胞株對(duì)溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL敏感，可誘導(dǎo)凋亡，并抑制IGF-1R和下游的NF-κB靶蛋白。ZD55-TRAIL與LY294002聯(lián)合可克服病毒本身引起的Akt/mTOR的激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，死亡受體DR5的上調(diào)可能是ZD55-TRAIL與MG132協(xié)同誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。這些發(fā)現(xiàn)為以后以TRAIL