RMP在肝臟惡性腫瘤中對自噬的調(diào)節(jié)及治療應(yīng)用.pdf

1、第一部分RMP在肝臟惡性腫瘤中對自噬的調(diào)節(jié)依賴于p53的狀態(tài)
　　研究背景和目的:肝臟惡性腫瘤(Hepatic malignancy)嚴(yán)重威脅著人類的健康。其中，肝癌(Livercancer)是成人常見的肝臟惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位于惡性腫瘤前十位。原發(fā)性肝癌（PLC）最重要的病理類型是肝細胞癌(HCC)，約70-85％為此類型。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝細胞癌與病毒感染、環(huán)境污染、遺傳易感等多種因素相關(guān)，然而其發(fā)生發(fā)展的具體分子機制仍不清

2、楚。目前對于肝癌的基礎(chǔ)研究越來越深入，針對肝癌的治療策略也越來越多樣，其中手術(shù)切除是肝癌治療最重要的方式。盡管臨床對于肝癌的分類、分型和分期日趨完善，但肝癌的整體治療效果難以令人滿意，究其原因，肝癌異質(zhì)性是導(dǎo)致治療效果差強人意的主要原因。因此，研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制能夠為更加細致的肝癌分類、分型提供分子基礎(chǔ)。肝母細胞瘤（HB）是嬰幼兒最常見的肝臟惡性腫瘤，約15％的肝母細胞瘤合并有遺傳綜合征，同時，多項研究發(fā)現(xiàn)肝母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展與

3、Wnt信號通路、Hedgehog信號通路等相關(guān)。因此，對肝母細胞瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究有利于我們對于肝臟惡性腫瘤更加立體、更加細致的認識。
　　自噬是細胞內(nèi)保守的生物進程，其通過溶酶體途徑降解細胞內(nèi)的錯誤折疊蛋白，損傷的細胞器等，成為細胞內(nèi)物質(zhì)分解再利用的重要方式。然而，過度的自噬同樣可以引起細胞死亡。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也呈雙向性，不同腫瘤、不同背景中的研究結(jié)果截然不同。自噬既能抑制腫瘤發(fā)生，又能通過抑制p53的激活促進腫瘤

4、發(fā)生;自噬既能通過對抗慢性炎癥、組織損傷和基因組不穩(wěn)定發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用，又能為應(yīng)激情況下腫瘤的生存發(fā)展提供必需的物質(zhì)。在同一腫瘤、不同分子背景的腫瘤中，自噬也發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)的作用。小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌中的一項研究發(fā)現(xiàn)，在p53正常存在的情況下，自噬發(fā)揮促進腫瘤的作用，當(dāng)敲除p53后，自噬發(fā)揮抑制腫瘤的作用。那么，在肝臟惡性腫瘤中，自噬究竟發(fā)揮怎樣的調(diào)節(jié)作用呢？
　　RMP（RNA polymerase subunit5-medi

5、ating protein）是RNA聚合酶第5亞基的調(diào)節(jié)蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，RMP在多種腫瘤組織中高表達，并通過誘導(dǎo)DNA損傷、抑制凋亡、促進轉(zhuǎn)移等機制發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。然而，RMP對腫瘤自噬的調(diào)節(jié)作用尚無相關(guān)研究。因此，以肝臟惡性腫瘤為研究對象，通過干擾RMP慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，在細胞水平檢測了干擾RMP對腫瘤細胞自噬的影響。發(fā)現(xiàn)了RMP在不同背景肝臟惡性腫瘤細胞中對自噬的分化調(diào)節(jié)，并研究了這種分化調(diào)節(jié)可能額分子機制。

6、　　研究方法:
　　1.收集肝母細胞瘤組織樣品，分別使用Western blot和RT-PCR檢測冰凍組織樣品中RMP的蛋白水平和mRNA水平;使用免疫組織化學(xué)方法檢測蠟塊組織切片中RMP的表達。
　　2.選擇肝母細胞瘤細胞系HepG2細胞和Huh6細胞，肝細胞癌細胞系SMMC7721細胞和Huh7細胞，分別用干擾RMP慢病毒構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。CCK-8和EdU實驗檢測干擾RMP對肝母細胞瘤細胞增殖的影響。
　　3.平板

7、克隆實驗檢測干擾RMP對肝母細胞瘤細胞克隆形成的影響。
　　4.使用SA-β-gal染色實驗以及細胞免疫免疫熒光檢測γ-H2AX的表達，檢測干擾RMP對肝母細胞瘤細胞衰老的影響。
　　5.檢測自噬溶酶體途徑直接底物p62的蛋白水平，反映干擾RMP對肝臟腫瘤細胞自噬的影響。
　　6.檢測對照組細胞和干擾RMP細胞中衰老相關(guān)分子的表達。因為p53對細胞增殖、衰老等呈單向調(diào)節(jié)，而對自噬調(diào)節(jié)呈雙向調(diào)節(jié)，選擇p53作為此項研究的

8、興趣分子。
　　7.使用CHX抑制翻譯檢測p53半衰期，使用DNA損傷性藥物Dox檢測p53的活性，研究肝臟惡性腫瘤細胞中p53的狀態(tài)。
　　8.使用過表達RMP質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染肝臟惡性腫瘤細胞，Western blot檢測p53蛋白。進一步驗證RMP對p53蛋白的調(diào)節(jié)作用。
　　9.使用免疫共沉淀檢測MDM2與p53結(jié)合的能力。
　　10.使用免疫共沉淀檢測p53與泛素分子UB的結(jié)合能力，反映p53的泛素化及總蛋白

9、泛素化。
　　11.使用RT-PCR檢測p53下游靶基因的表達，使用胞漿胞核分離技術(shù)檢測干擾RMP后，細胞各組分中p53蛋白的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.RMP在肝母細胞瘤組織中的表達:肝母細胞瘤冰凍組織和石蠟包塊組織中，RMP均高表達。
　　2.RMP對肝母細胞瘤細胞增殖的影響:干擾RMP能明顯抑制肝母細胞瘤細胞HepG2和Huh6的增殖能力。
　　3.RMP對肝母細胞瘤細胞克隆形成的影響:干擾RMP

10、能明顯抑制肝母細胞瘤細胞HepG2和Huh6的克隆形成能力。
　　4.RMP對肝母細胞瘤細胞衰老的影響:干擾RMP能促進肝母細胞瘤細胞HepG2和Huh6發(fā)生衰老。
　　5.RMP對肝臟惡性腫瘤細胞自噬的影響:在HepG2細胞和SMMC7721細胞中，干擾RMP抑制自噬;在Huh6細胞和Huh7細胞中，干擾RMP促進自噬。
　　6.RMP對衰老相關(guān)分子的調(diào)節(jié):干擾RMP明顯上調(diào)衰老相關(guān)分子p16、p53、p21的表達。

11、
　　7.不同肝臟惡性腫瘤細胞中p53的狀態(tài):HepG2細胞和SMMC7721細胞中的野生型p53半衰期約20-30分鐘，能夠被Dox激活;Huh6細胞和Huh7細胞中突變型p53半衰期約6-8小時，Dox刺激下蛋白不上調(diào)。
　　8.RMP對p53蛋白的調(diào)節(jié):過表達RMP能夠明顯下調(diào)p53蛋白。
　　9.RMP對MDM2與p53結(jié)合能力的影響:干擾RMP，MDM2與p53的結(jié)合明顯減少。
　　10.RMP對p53

12、蛋白泛素化和總蛋白泛素化的影響:干擾RMP，明顯減少p53蛋白泛素化和總蛋白泛素化。因此，RMP通過影響p53泛素化，調(diào)節(jié)p53的蛋白穩(wěn)定性。
　　11.RMP通過對p53蛋白的調(diào)節(jié)影響自噬:干擾RMP所誘導(dǎo)的p53蛋白并不影響下游靶基因的表達。干擾RMP主要引起胞漿中野生型p53蛋白升高，進而發(fā)揮抑制自噬的作用。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)RMP在肝母細胞瘤組織中高表達。細胞實驗發(fā)現(xiàn)RMP促進了肝母細胞瘤細胞的增殖、克隆形成，并

13、抑制細胞衰老，然而RMP對細胞自噬的調(diào)節(jié)呈現(xiàn)雙向性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RMP能明顯抑制p53蛋白表達。機制研究發(fā)現(xiàn)，RMP通過促進MDM2與p53的結(jié)合從而促進了p53蛋白泛素蛋白酶體途徑的降解。同時發(fā)現(xiàn)RMP對p53蛋白的調(diào)節(jié)并不影響其下游靶基因的表達，胞漿胞核分離實驗發(fā)現(xiàn)RMP主要減少了胞漿中基礎(chǔ)p53，進而促進細胞自噬。
　　第二部分p53的狀態(tài)決定了自噬對蛋白酶體抑制劑所誘導(dǎo)的凋亡的調(diào)節(jié)作用
　　研究背景和目的:自噬是

14、依賴于溶酶體的細胞內(nèi)物質(zhì)的降解通路。一方面，它能將細胞內(nèi)不需要的組分降解生成細胞必須的營養(yǎng)成分，從而實現(xiàn)了細胞內(nèi)物質(zhì)的再利用;另一方面，當(dāng)自噬過度激活時，細胞也能被這種“自我消化”式的降解途徑所損傷，引起細胞死亡。與此同時，自噬與其他引起細胞死亡的方式之間也存在非常重要的聯(lián)系。
　　自噬對于凋亡的調(diào)節(jié)因研究的背景不同呈現(xiàn)明顯的分化。一部分研究發(fā)現(xiàn)，自噬能夠通過特異性地降解促凋亡分子如Caspase8等發(fā)揮抑制凋亡的作用;而自噬的特

15、殊類型線粒體自噬還可以通過清除受損的線粒體，減少內(nèi)源性促凋亡因子的釋放，抑制內(nèi)源性凋亡通路。然而，另一部分研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因能夠與Caspase8結(jié)合，促進Caspase8的活化;同時，自噬也能特異性降解內(nèi)源性自噬抑制分子，這些機制均表明自噬能夠促進凋亡。因此，自噬對凋亡的調(diào)節(jié)作用完全取決于上下文關(guān)系。不同研究中細胞的分子背景不同，可能是引起這種“相互矛盾”結(jié)果的原因之一。
　　p53是重要的抑癌基因，它在細胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)

16、中均發(fā)揮重要作用?；罨膒53在胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子，能轉(zhuǎn)錄激活多種促凋亡靶基因;而胞漿中活化的p53能夠在線粒體與多種促凋亡分子、抑制凋亡分子相互作用，最終促進細胞凋亡。p53對自噬調(diào)節(jié)也因研究背景的不同而呈現(xiàn)雙向性，之前的研究認為，活化的p53在胞核中能夠激活促自噬相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的DNA損傷能夠誘導(dǎo)p53轉(zhuǎn)錄激活自噬抑制分子FBXL20;胞漿中非活化的p53通過抑制自噬小體的形成發(fā)揮抑制自噬的作用。因此，我們

17、猜想p53在自噬對凋亡的雙重調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要的作用。
　　泛素蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)另一個重要的細胞內(nèi)物質(zhì)降解通路，而蛋白酶體抑制劑能在多種腫瘤細胞中引起自噬和凋亡。因此，我們使用蛋白酶體抑制劑處理肝臟惡性腫瘤細胞。發(fā)現(xiàn)，其同樣能引起自噬和凋亡。然而，我們預(yù)先激活自噬后，再使用蛋白酶抑制劑處理，細胞的凋亡程度出現(xiàn)明顯分化。隨后我們發(fā)現(xiàn)p53的狀態(tài)可能是引起這種分化的原因之一。
　　研究方法:
　　1.蛋白酶體抑制劑MG

18、132處理肝臟腫瘤細胞，Western blot檢測p62的表達，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化以及熒光顯微鏡觀察GFP-LC3顆粒的形成，反應(yīng)MG132對肝臟腫瘤細胞自噬的調(diào)節(jié)。
　　2.MG132處理細胞后，Western blot檢測PARR以及PARP cleavage的表達，反應(yīng)MG132對肝臟腫瘤細胞凋亡的調(diào)節(jié)。
　　3.EBSS處理細胞預(yù)激活自噬，再使用MG132刺激細胞，檢測PARP、PARPcleavage的

19、表達以及熒光顯微鏡觀察PI染色情況，判斷預(yù)激活自噬對MG132所誘導(dǎo)凋亡的影響。
　　4.Western blot檢測MG132作用下細胞內(nèi)與自噬、凋亡相關(guān)分子的變化情況。
　　5.對預(yù)激活自噬反應(yīng)差異的細胞中p53的鑒定，CHX抑制翻譯檢測p53半衰期，直接測序法鑒定p53是否突變，使用DNA損傷性藥物Dox檢測不同狀態(tài)p53的反應(yīng)，使用DNA結(jié)合區(qū)外位點的磷酸化p53抗體檢測突變對于突變區(qū)外磷酸化位點的影響。
　　

20、6.Western blot檢測預(yù)激活自噬對于突變型p53蛋白的影響。
　　7.MG132所引起突變型p53降解的原因，Western blot檢測自噬抑制劑對于突變型p53蛋白的影響，溶酶體探針檢測MG132對溶酶體的調(diào)節(jié)，RT-PCR檢測MG132作用下p53的轉(zhuǎn)錄是否受到影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.MG132作用下，肝母細胞瘤細胞HepG2、Huh6以及肝細胞癌細胞SMMC7721、Huh7的自噬均被激活。<

21、br>　　2.MG132促進了肝臟腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
　　3.EBSS處理預(yù)激活自噬，再使用MG132刺激，HepG2細胞和SMMC7721細胞的凋亡增多，而Huh6細胞和Huh7細胞的凋亡減少。
　　4.檢測相關(guān)分子變化后我們發(fā)現(xiàn)在上述兩組細胞中，MG132作用下p53蛋白變化情況正好相反。
　　5.HepG2細胞和SMMC7721細胞中為野生型p53，而Huh6細胞和Huh7細胞中的p53在DNA結(jié)合區(qū)發(fā)生了點突變

22、(Huh6-A159D，Huh7-Y220C)。
　　6.預(yù)激活自噬明顯逆轉(zhuǎn)了MG132所誘導(dǎo)的突變型p53的降解。
　　7.MG132作用下突變型p53蛋白降解可能依賴于溶酶體功能的超激活，以及MG132對于p53的轉(zhuǎn)錄抑制。
　　結(jié)論:本研究使用蛋白酶體抑制劑MG132處理肝臟腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)其能激活自噬并誘導(dǎo)細胞凋亡。預(yù)激活自噬后，再使用MG132刺激細胞，細胞的凋亡出現(xiàn)明顯分化，其中HepG2細胞和SMMC772