生殖器官惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移動物模型的建立及其相關(guān)研究.pdf

1、研究背景：
　　 癌癥作為當(dāng)今世界的主要死亡原因之一，近年來呈逐年上升趨勢。腫瘤對人體的危害不僅限于原發(fā)灶對機體造成的，而更重要的是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其是造成患者死亡的主要原因。盡管醫(yī)療技術(shù)水平不斷提高，但對于腫瘤早期轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)和晚期轉(zhuǎn)移的治療仍然缺乏強而有效的措施。因此為了進一步研究腫瘤的各種相關(guān)機制及其進一步治療措施，建立與臨床表現(xiàn)相近的腫瘤動物模型是非常有必要的。
　　 在腫瘤動物模型，尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移模型發(fā)展過程中

2、有兩個重要思想，即原位移植戰(zhàn)略和腫瘤細(xì)胞異質(zhì)論.原位移植戰(zhàn)略是指將人類腫瘤接種到與腫瘤原發(fā)部位相對應(yīng)的移植宿主器官組織內(nèi)，使其獲得與人體腫瘤相似的微環(huán)境；腫瘤細(xì)胞異質(zhì)論認(rèn)為在同一腫瘤內(nèi)含有生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)移行為不完全相同的各種細(xì)胞亞群，轉(zhuǎn)移能否發(fā)生在很大程度上取決于具有轉(zhuǎn)移能力的極少部分細(xì)胞能否轉(zhuǎn)變成占優(yōu)勢的腫瘤細(xì)胞亞群。本課題利用T細(xì)胞免疫缺陷的裸小鼠進行了人宮頸癌細(xì)胞(SiHa、CaSki、HeLa)、卵巢癌細(xì)胞(Skov3、A278

3、0)多水平、多層次的接種移植，對其進行生物學(xué)特性觀察，并根據(jù)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)論篩選出了具有高淋巴轉(zhuǎn)移潛能的人宮頸癌(SiHa)細(xì)胞亞群，建立了相應(yīng)動物模型。
　　 利用生物發(fā)光(如熒光素酶)或熒光激發(fā)(如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白)檢測系統(tǒng)進行活體細(xì)胞示蹤，通過配有活體顯微鏡的體外顯影技術(shù)能夠?qū)膊纳倭考?xì)胞到大塊腫瘤的全過程進行定量分析，使人們能夠在活體動物體內(nèi)觀察腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。另外，還可運用多種熒光蛋白追蹤個別動物的特殊細(xì)

4、胞群以減少動物之間的差異。本試驗利用攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)基因的慢病毒載體感染人宮頸癌SiHa、CaSki細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的宮頸癌細(xì)胞，建立了整體可視化宮頸癌原位移植動物模型。
　　 目的：
　　 1、在人癌試驗基礎(chǔ)上建立多種裸鼠宮頸癌、卵巢癌動物模型，為研究婦科惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機制、早期診斷以及治療奠定良好的動物學(xué)基礎(chǔ)。
　

5、　 2、通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立裸鼠宮頸癌原位移植腫瘤及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的整體可視化模型，使人們可以在活體狀態(tài)下觀察腫瘤的演進規(guī)律。
　　 3、對已標(biāo)記EGFP的人宮頸癌(SiHa)細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)外連續(xù)傳代及原代培養(yǎng)，篩選出具有高淋巴轉(zhuǎn)移潛能的宮頸癌細(xì)胞亞群。
　　 方法：
　　 1、常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)宮頸癌(SiHa、CaSki、HeLa)細(xì)胞株、卵巢癌(Skov3、A2780)細(xì)胞株，進行皮下接種后密切觀察其皮下成瘤

6、情況。
　　 2、利用含EGFP基因的重組慢病毒(lentivirus)轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa、CaSki細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測、篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的宮頸癌細(xì)胞，用獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進行裸小鼠尾根部注射，待其出現(xiàn)衰竭體征時在整體熒光成像儀提示下取遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶及淋巴結(jié)原代培養(yǎng)，培養(yǎng)篩選出細(xì)胞再次鼠尾根部注射，上述過程重復(fù)3次篩選出具有高淋巴轉(zhuǎn)移潛能的宮頸癌SiHa細(xì)胞亞系。
　　 3、將篩選出的高轉(zhuǎn)移潛能宮頸癌SiHa/EG

7、FP細(xì)胞接種到裸小鼠皮下，待皮下瘤長至0．3-0．5cm3大小時取出、剪至1mm3大小碎片皮下移植，重復(fù)上述過程3次，用第三代皮下瘤進行裸小鼠宮頸水平位置原位移植。借助整體熒光體視鏡和IPPS．0軟件，采集分析EGFP發(fā)出的熒光信號，在動物活體內(nèi)實時觀察宮頸癌局部成瘤及轉(zhuǎn)移情況，并應(yīng)用常規(guī)病理學(xué)方法進行評價和鑒定。
　　 4、將人卵巢癌Skov3細(xì)胞接種到裸鼠皮下形成卵巢癌裸鼠皮下瘤，取出皮下瘤并剪成1-2mm3大小的組織塊，接

8、種至另一裸小鼠一側(cè)卵巢，建立人卵巢癌原位移植模型。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立了穩(wěn)定表達(dá)EGFP的宮頸癌SiHa、CaSki細(xì)胞系，篩選出具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的宮頸癌SiHa細(xì)胞亞群，建立了整體可視化宮頸癌高轉(zhuǎn)移動物模型?？梢杂^測到宮頸癌腫瘤首先長入整個生殖道，形成較大局部包塊，侵犯局部淋巴結(jié)，遠(yuǎn)處淋巴結(jié)，后來轉(zhuǎn)移至肺和其他臟器。而且發(fā)現(xiàn)腫瘤大小與轉(zhuǎn)移范圍呈正比關(guān)系。
　　 2卵巢癌細(xì)胞Skov3皮下注射、原位

9、移植成瘤率100％。原位移植卵巢癌首先在局部形成包塊，與周圍組織發(fā)生粘連，造成局部侵犯，晚期小鼠消瘦、皮膚蒼白、腹腔積液伴腹腔廣泛種植性轉(zhuǎn)移。
　　 3、宮頸癌細(xì)胞株(SiHa、CaSki、HeLa)單細(xì)胞懸液(2×106個/只)皮下、尾根部注射及組織塊原位移植成瘤率均100％。細(xì)胞懸液皮下注射接種時，同種細(xì)胞、同時間點、同細(xì)胞數(shù)接種成瘤時間不一，成瘤大小不均，成瘤后瘤塊生長速度因腫瘤細(xì)胞類型不同而不同，生長速度最快的為HeLa

10、，其次CaSki，最慢的為SiHa。
　　 4、本實驗共對5只荷瘤鼠的皮下瘤進行了部分切除，手術(shù)后發(fā)現(xiàn)原發(fā)瘤明顯充血并急速增大，均在8-15天內(nèi)死亡。
　　 5、宮頸癌HeLa細(xì)胞皮下接種4只(其中1只為雄性)，接種后3只雌性鼠平均壽命34天，另一只雄性鼠壽命為46天，且腫瘤生長緩慢，體積明顯小于雌性鼠。
　　 結(jié)論：
　　 1、建立了與臨床表現(xiàn)相似的婦科腫瘤動物模型，為深入研究腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機制、探索新型

11、影像造影劑、對具有潛在可能性治療方法的評估奠定了良好的動物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 2、建立了穩(wěn)定表達(dá)EGFP的宮頸癌SiHa細(xì)胞系，并利用體內(nèi)、外連續(xù)傳代、篩選和原代培養(yǎng)的方法分選出具有高轉(zhuǎn)移潛能宮頸癌細(xì)胞亞群，建立相應(yīng)動物模型。
　　 3、在整體熒光成像系統(tǒng)提示下，發(fā)現(xiàn)宮頸癌原位移植瘤早期為局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并侵犯臨近臟器，再轉(zhuǎn)移到肺或其他臟器。
　　 創(chuàng)新點：
　　 在人癌實驗層次基礎(chǔ)上進行了多水