可注射性殼聚糖-磷酸甘油復(fù)合異體軟骨細胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的初步研究.pdf

1、研究背景與目的: 創(chuàng)傷、骨病等所致關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床十分常見。關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏血管分布，當(dāng)缺損大于直徑3mm時不能自身修復(fù)。目前臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法很多，但還沒有公認最優(yōu)的能實現(xiàn)長期透明軟骨修復(fù)的方法。組織工程技術(shù)是再生修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損最具潛力的方法之一。近年來，隨著微創(chuàng)理論被廣泛接受和各種新型可注射性醫(yī)用材料的出現(xiàn)，構(gòu)建可注射性組織工程軟骨的研究成為熱點。可注射性軟骨制備技術(shù)將組織工程技術(shù)與微創(chuàng)技術(shù)有機結(jié)合，從而具備了良

2、好的臨床應(yīng)用前景。 目前用于軟骨組織工程中的可注射性天然凝膠材料和人工合成聚合物凝膠均存在某些不足。殼聚糖作為一種天然多糖聚合物，其分子結(jié)構(gòu)和理化生物學(xué)性質(zhì)與軟骨細胞外重要基質(zhì)——透明質(zhì)酸相似。能夠模擬關(guān)節(jié)腔滑液和關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)，有利于潤滑關(guān)節(jié)、促進軟骨再生。因此探討殼聚糖及其衍生物用于組織工程關(guān)節(jié)軟骨支架的可行性具有重要意義。 體外、體內(nèi)異位構(gòu)建或者用于修復(fù)頜面、食管等部位軟骨缺損的可注射性組織工程軟骨的相關(guān)研究報

3、道較多，而直接注入關(guān)節(jié)腔原位構(gòu)建組織工程軟骨并再生修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的報道較少。2000年Chenite最早報道了具有溫固化特性的殼聚糖/磷酸甘油(Chitosan/Glycerophosphate，C/GP)凝膠以來，其應(yīng)用研究主要在藥物載體，而有關(guān)組織工程支架方面的研究甚少，尚未見C/GP復(fù)合軟骨細胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的報道。為此，本實驗通過制備能滿足可注射性組織工程支架要求的C/GP凝膠，對C/GP進行初步的生物相容性和在體安全性評價

4、。再將其作為軟骨組織工程支架，制備C/GP-關(guān)節(jié)軟骨細胞混懸液，分別于細胞恒溫培養(yǎng)箱體外構(gòu)建與培養(yǎng)，直接注入異體大耳白兔皮下和注入預(yù)先制備有關(guān)節(jié)軟骨缺損動物模型的關(guān)節(jié)腔內(nèi)。于一定時間，觀察細胞-支架復(fù)合物體外培養(yǎng)、異體皮下成軟骨能力，以及C/GP復(fù)合同種異體軟骨細胞注入再生修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的有效性和可行性。為臨床可注射性組織工程軟骨的制備及其修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供理論與實驗依據(jù)。 研究方法: 1.可注射性C/GP支架制備及

5、其生物相容性評價 (1)將殼聚糖與甘油磷酸二鈉兩種溶液按不同容積比(volumeratio,v/v)均勻混合，測量pH值，置37℃水浴中，記錄其形成凝膠態(tài)所需時間，選擇殼聚糖與甘油磷酸二鈉兩種溶液在37℃形成凝膠的最適混合容積比。 (2)細胞相容性觀察：以幼齡大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨細胞接種于C/GP表面貼壁生長，檢測凝膠表面的軟骨細胞粘附率；掃描電子顯微鏡(Scanningelectronmicroscope，SEM)觀察細胞

6、與支架的粘附；將C/GP與幼齡大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨細胞復(fù)合體外三維培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察凝膠中細胞形態(tài)與分布，并行四甲基偶氮唑藍(Methylthiotetrazole，MTT)染色，計算細胞存活率。 (3)組織相容性觀察：將一定量的C/GP于成年免的腹腔、皮內(nèi)及皮下注射，觀察其全身急性中毒反應(yīng)和組織炎性反應(yīng)。 2.可注射性C/GP-軟骨細胞復(fù)合物制備及其修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損觀察 (1)將適合容積比C/GP與幼兔關(guān)節(jié)軟骨

7、細胞復(fù)合物體外構(gòu)建與培養(yǎng)，分別于第1、4周，行蘇木精-伊紅(Haematoxylin-eosin，HE)、甲苯胺藍(Toluidineblue，TB)組織學(xué)染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色，即鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(Immunohistochemistry-Streptavidin-biotincomplex，IH-SABC)，觀察所構(gòu)建軟骨的組織學(xué)形態(tài)和主要基質(zhì)——GAGs和Ⅱ型膠原的分泌分布情況。 (2)將C/

8、GP-同種異體幼兔關(guān)節(jié)軟骨細胞復(fù)合物，注射于成年兔背部皮下。術(shù)后4、8、12周行大體和組織學(xué)觀察，評估其體內(nèi)異位成軟骨能力。 (3)制備成年兔膝關(guān)節(jié)股骨滑車軟骨缺損模型。將C/GP-同種異體幼兔關(guān)節(jié)軟骨細胞復(fù)合物，適量注射于成年兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。術(shù)后4、8、12周行大體觀察、組織學(xué)檢測和改良Wakitani法評分，評價其對關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生修復(fù)效果，并與單純支架修復(fù)和空白對照組進行統(tǒng)計學(xué)比較分析。 研究結(jié)果: 1.可

9、注射性C/GP支架制備及其生物相容性評價 (1)將殼聚糖和甘油磷酸二鈉的兩種溶液以7∶1(v/v)混合，其混合液pH值為7.2，于37℃水浴中10min可形成凝膠。 (2)C/GP凝膠支架具有良好的細胞相容性。幼兔關(guān)節(jié)軟骨細胞接種于C/GP凝膠表面，其4h時細胞貼壁率為87.2％；SEM示細胞伸出偽足與材料結(jié)合；倒置顯微鏡下可見細胞定植于凝膠中，細胞形態(tài)保持球型；MTT檢測提示細胞存活良好，存活率為95％以上。

10、(3)105mg/Kg的C/GP不引起成年兔的全身中毒反應(yīng)；C/GP無皮膚刺激反應(yīng)及局部組織明顯的炎性反應(yīng)。 2.可注射性C/GP-軟骨細胞復(fù)合物制備及其修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損觀察 (1)C/GP復(fù)合幼兔關(guān)節(jié)軟骨細胞體外三維培養(yǎng)，培養(yǎng)1w時，組織塊具一定韌性；組織學(xué)觀察可見軟骨陷窩，細胞周圍有GAGs和Ⅱ型膠原，支架被嗜酸性的伊紅染色。培養(yǎng)4周時，軟骨形態(tài)較為典型，基質(zhì)分泌增多，組織形態(tài)為軟骨樣結(jié)構(gòu)，支架有明顯降解。

11、 (2)C/GP復(fù)合幼兔關(guān)節(jié)軟骨細胞異體皮下注入4周時，組織塊具有一定韌性；組織學(xué)觀察為軟骨樣組織，組織塊周圍是纖維組織包裹，無明顯炎性細胞侵潤，支架大部降解；8周時支架完全降解；12周時，所構(gòu)建組織塊韌性增強，組織學(xué)觀察為透明軟骨樣結(jié)構(gòu)。 (3)采用C/GP復(fù)合同種異體幼兔關(guān)節(jié)軟骨細胞混懸液，1ml每膝，注射于預(yù)先制備的成年兔膝關(guān)節(jié)股骨滑車軟骨缺損模型膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。4-12周觀察期內(nèi)軟骨缺損的修復(fù)表面平整，色澤趨向正常與周圍組織

12、整合良好；術(shù)后12周，修復(fù)組織具有透明軟骨樣結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生GAGs和Ⅱ型膠原，與周圍透明軟骨相似，改良Wakitani評分示實驗組修復(fù)效果明顯優(yōu)于單純支架組和空白對照組，觀察期內(nèi)未見毛細血管長入及免疫排斥反應(yīng)發(fā)生；單純支架組為纖維軟骨修復(fù)，而空白組為少量纖維組織覆蓋缺損底面。 研究結(jié)論: 1.篩選出適宜于構(gòu)建可注射性組織工程關(guān)節(jié)軟骨的C/GP凝膠支架，殼聚糖和甘油磷酸二鈉兩種溶液按容積比7∶1混合后的pH值為7.2，具有37

13、℃水浴中10min內(nèi)形成凝膠的特點，并具有較好的生物相容性與安全性。 2.以C/GP凝膠為支架體外構(gòu)建的可注射性組織工程關(guān)節(jié)軟骨，具有一定的強度，組織形態(tài)為軟骨樣結(jié)構(gòu)，細胞有較強的分泌GAGs和Ⅱ型膠原的能力。組織學(xué)HE染色觀察，在1、4周時可見伊紅深染的C/GP支架殘余。 3.C/GP-關(guān)節(jié)軟骨細胞復(fù)合物異體皮下構(gòu)建的可注射性組織工程關(guān)節(jié)軟骨，具有一定韌性，體內(nèi)熟化12周其韌性增強；構(gòu)建組織細胞有較強的分泌GAGs和Ⅱ