線粒體內(nèi)膜蛋白Mitofilin在白癜風(fēng)發(fā)病中作用研究.pdf

1、白癜風(fēng)是一種以皮損處色素脫失為特征的慢性皮膚疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。以往的研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制與遺傳、自身免疫、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，近年來(lái)氧化應(yīng)激成為白癜風(fēng)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。多巴胺氧化是黑素細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞特有的氧化應(yīng)激形式，多項(xiàng)研究證實(shí)多巴胺氧化可以影響多巴胺能神經(jīng)元線粒體的正常形態(tài)和功能。線粒體是真核細(xì)胞中最重要的細(xì)胞器之一，是細(xì)胞有氧呼吸的主要場(chǎng)所，在細(xì)胞代謝和能量產(chǎn)生過程中扮演著重要角色。同時(shí)線粒體也是細(xì)胞內(nèi)

2、氧自由基的最重要來(lái)源，更是活性氧的主要攻擊對(duì)象。線粒體的形態(tài)異常會(huì)加速氧自由基的產(chǎn)生，當(dāng)線粒體受到氧化損傷不能代償時(shí)，會(huì)激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　多位學(xué)者從與多巴胺氧化相關(guān)的基因多態(tài)性、多巴胺氧化產(chǎn)物在皮損局部和全身的蓄積、多巴胺氧化對(duì)黑素細(xì)胞的影響等不同方面進(jìn)行研究，提示多巴胺氧化與白癜風(fēng)發(fā)病關(guān)系密切。本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)：白癜風(fēng)患者血液循環(huán)中存在高滴度針對(duì)Mitofilin的自身抗體，Mitofilin是定位于線

3、粒體內(nèi)膜的錨定蛋白，雖然Mitofilin的功能目前尚不完全清楚，但其在維持線粒體內(nèi)膜和嵴的正常形態(tài)方面的關(guān)鍵性作用已為世人所公認(rèn)。在HeLa細(xì)胞中特異性下調(diào)Mitofilin時(shí)，線粒體內(nèi)膜重構(gòu)，嵴形態(tài)消失，線粒體內(nèi)活性氧增高，細(xì)胞凋亡增加。同時(shí)Mitofilin在修復(fù)mtDNA、維護(hù)線粒體內(nèi)基因組穩(wěn)定方面扮演著重要的角色。新近的研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)皮損區(qū)周圍的黑素細(xì)胞線粒體變得非常巨大，同時(shí)線粒體嵴的形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化，進(jìn)一步提示Mit

4、ofilin可能在白癜風(fēng)發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。
　　黑素細(xì)胞與多巴胺能神經(jīng)元共同起源于外胚層神經(jīng)嵴，并且都具有多巴胺代謝功能。我們推測(cè)多巴胺氧化條件下黑素細(xì)胞Mitofilin表達(dá)水平將下降，進(jìn)而導(dǎo)致其線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，產(chǎn)生更多的活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞陷入氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)之中，最終激活包括線粒體途徑在內(nèi)的多條凋亡通路，導(dǎo)致黑素細(xì)胞凋亡，這可能是白癜風(fēng)中黑素細(xì)胞喪失的機(jī)制之一。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)：Mitofilin作為白癜風(fēng)相

5、關(guān)抗原的確認(rèn)
　　1.主要方法
　　提取黑素瘤細(xì)胞膜蛋白，利用白癜風(fēng)自身抗體陽(yáng)性血清和Mitofilin抗體分別與膜蛋白行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，所得樣品再行Westernblot檢測(cè)線粒體內(nèi)膜蛋白Mitofilin。
　　2.主要結(jié)果
　　Westernblot結(jié)果顯示在90kDa附近，白癜風(fēng)血清組和Mitofilin抗體組均出現(xiàn)了陽(yáng)性條帶。
　　3.主要結(jié)論
　　白癜風(fēng)陽(yáng)性血清中包含有針對(duì)Mitofilin

6、的自身抗體，提示Mitofilin在白癜風(fēng)發(fā)病中起重要作用。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)：多巴胺對(duì)黑素細(xì)胞、Mitofilin及線粒體的影響
　　1.主要方法
　　300μM、500μM、1000μM多巴胺處理永生化的人表皮黑素細(xì)胞系PIG1，于處理后24h、24h及48h分別進(jìn)行結(jié)晶紫染色、流式細(xì)胞術(shù)及Westernblot檢測(cè)黑素細(xì)胞增殖活性、凋亡及Mitofilin被抑制的情況。500μM多巴胺處理黑素細(xì)胞PIG1，24h

7、后利用JC-1染料檢測(cè)線粒體內(nèi)膜電位變化。300μM多巴胺處理黑素細(xì)胞PIG1，72h后透射電鏡觀察細(xì)胞器變化。每次處理均設(shè)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。
　　2.主要結(jié)果
　　多巴胺抑制黑素細(xì)胞增殖活性并誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡，與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多巴胺處理明顯降低黑素細(xì)胞Mitofilin蛋白及線粒體內(nèi)膜電位水平。多巴胺處理使黑素細(xì)胞線粒體內(nèi)膜、嵴明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹，染色質(zhì)邊集，凋亡小體形成。
　　3.主要結(jié)論<

8、br>　　多巴胺處理后，黑素細(xì)胞Mitofilin蛋白明顯下降，并因此導(dǎo)致線粒體形態(tài)和線粒體電位水平的異常，可能激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　第三部分實(shí)驗(yàn)：多巴胺通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體途徑誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡
　　1.主要方法
　　500μM多巴胺分別處理黑素細(xì)胞PIG11h、3h、6h、12h，Westernblot檢測(cè)GRP78、PKR、P-PKR、P-eIF2α、Caspase-3、Caspase-9、Bax、B

9、cl-2、β-actin等蛋白表達(dá)水平。
　　2.主要結(jié)果
　　在內(nèi)參照β-actin不變的情況下，GRP78、P-PKR、P-eIF2α、Caspase-3、Caspase-9、Bax較對(duì)照組明顯升高，Bcl-2水平明顯降低，PKR水平未發(fā)生明顯變化。
　　3.主要結(jié)論
　　多巴胺激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑及線粒體途徑誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡。
　　本研究首次證實(shí)白癜風(fēng)患者體內(nèi)存在高滴度針對(duì)Mitofilin的自身抗體；明確

10、Mitofilin為黑素細(xì)胞多巴胺氧化的靶蛋白之一；證實(shí)多巴胺通過下調(diào)Mitofilin影響黑素細(xì)胞線粒體的正常形態(tài)和功能，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡。
　　我們推測(cè)在白癜風(fēng)中存在著一個(gè)惡性循環(huán)：黑素細(xì)胞中多巴胺或多巴醌代謝紊亂，產(chǎn)生過量的氧自由基，超出了機(jī)體自身抗氧化系統(tǒng)處理能力，抑制抗氧化系統(tǒng)功能，從而攻擊包括線粒體在內(nèi)的生物膜系統(tǒng)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生大量丙二醛類小分子。丙二醛等小分子與細(xì)胞蛋白質(zhì)、DN

11、A等非特異性結(jié)合，影響細(xì)胞正常功能。同時(shí)，多巴醌也能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，影響包括Mitofilin、SOD在內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)量和功能，從而影響到線粒體的形態(tài)、功能和復(fù)制。異常的線粒體功能導(dǎo)致更大量氧自由基的產(chǎn)生，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)之中，最終激活包括線粒體途徑在內(nèi)的多條通路，導(dǎo)致細(xì)胞的壞死和凋亡。而細(xì)胞中蓄積的大量被變異調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)如Mitofilin，釋放到細(xì)胞外，在局部炎癥因子的參與下，被抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別，激活B細(xì)胞，最終產(chǎn)生了