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文檔簡(jiǎn)介
1、本文利用基因工程手段通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗旱、耐鹽基因PSCS轉(zhuǎn)化到向日葵中,并成功獲得了PCR-Southern雜交檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株,為向日葵的抗旱、耐鹽育種研究提供新的試驗(yàn)依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下: 1、通過(guò)PCR對(duì)載體pBIP5CS-F129A進(jìn)行特異性擴(kuò)增,獲得了目的基因PSCS(1905bp)并對(duì)其進(jìn)行克隆。利用限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ將目的基因從克隆重組質(zhì)粒消化下來(lái),定向插入到植物表達(dá)載體pC
2、HF3的CaMV35S啟動(dòng)子下游和NOS終止子上游,成功地構(gòu)建了PSCS基因植物表達(dá)載體pCHF3/PSCS,通過(guò)凍融法將此表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中,提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒,經(jīng)PCR鑒定表明P5CS基因植物表達(dá)雙元載體構(gòu)建成功。 2、以向日葵保持系75-33B和恢復(fù)系Ht80-97為轉(zhuǎn)化受體材料,用攜帶PSCS基因的雙元載體系統(tǒng)的根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行葉盤轉(zhuǎn)化,獲得抗Kan的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)化植株總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),以表達(dá)載體重組質(zhì)
3、粒pCHF3/P5CS的PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照,以非轉(zhuǎn)基因向日葵基因組pCR產(chǎn)物為陰性對(duì)照,對(duì)轉(zhuǎn)基因向日葵基因組進(jìn)行PCR-Southern雜交檢測(cè),證實(shí)獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株75-33B為2株,Ht80-97為4株,轉(zhuǎn)化率分別是3.17%和4.65%。 3、試驗(yàn)中對(duì)抗性芽篩選的Kan濃度設(shè)定為25mg/L,農(nóng)桿菌的侵染濃度OD<,600nm>值為0.8,通過(guò)設(shè)定三個(gè)不同侵染時(shí)間(10min、20min和30min)的處理,結(jié)果經(jīng)分析
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