豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定和感染裸鼠、Balb-c小鼠的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引發(fā)豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，但。PCV2單獨(dú)感染并不導(dǎo)致臨床癥狀。PCV2能在豬單核巨噬細(xì)胞中增殖，可造成免疫細(xì)胞的數(shù)量減少，并出現(xiàn)了低密度的未成熟粒細(xì)胞，從而使感染豬細(xì)胞免疫功能大大降低，缺乏有效的免疫應(yīng)答能力。PCV2的致病

2、機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)，但許多實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)完成，難以準(zhǔn)確反映體內(nèi)情況，而感染動(dòng)物模型多選用價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)困難的SPF豬。由此，本實(shí)驗(yàn)選用了裸鼠及Batb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)，反映了PCV2在小鼠體內(nèi)增殖和致病情況。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)用PCV2感染裸鼠，裸鼠由于T淋巴細(xì)胞缺陷，不能執(zhí)行正常T淋巴細(xì)胞功能，可能對(duì)PCV2更為易感。 根據(jù)GenBank中豬圓環(huán)病毒1型和2型的序列，設(shè)計(jì)2對(duì)套式PCR引物，對(duì)13份病料進(jìn)行了PC

3、V2檢測(cè)，檢測(cè)到了2份PCV2陽(yáng)性病料。另外根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已建立方法進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)到4份PCV2陽(yáng)性病料。取其中1份病料樣品研磨后，凍融3次，0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌接種PKl5細(xì)胞，連續(xù)傳代。提取細(xì)胞培養(yǎng)物中的DNA.做PCR鑒定，并用直接免疫熒光和間接免疫熒光進(jìn)行鑒定第15代細(xì)胞。 用豬圓環(huán)病毒2型經(jīng)腹腔注射Balb/c小鼠及裸鼠，每隔兩周1次，共感染3次。每周用PCR方法檢測(cè)小鼠病毒血癥，ELISA法檢測(cè)小鼠血

4、清抗體水平。六周后取小鼠脾臟，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，非放射性乳酸脫氫酶釋放法(u)H法)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性及細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾T淋巴細(xì)胞亞類(lèi)CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>數(shù)量及B淋巴細(xì)胞亞類(lèi)CD19<'+>數(shù)量。 結(jié)果表明裸鼠初次、再次感染后并未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，但可以從血清中檢測(cè)到病毒核酸；未檢測(cè)到PCV2 ORF2的抗體；臟器中檢測(cè)到病毒核酸；同時(shí)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)無(wú)顯著增強(qiáng)，除

5、NK細(xì)胞殺傷率顯著升高，各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著改變。 Balb/c小鼠初次、再次感染后小鼠并未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，但可以從血清中檢測(cè)到病毒核酸及PCV2 ORF2的抗體；同時(shí)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著增強(qiáng)，NK細(xì)胞殺傷率顯著升高，CTL殺傷率顯著升高；CD4<'+>、CD8<'+>、CD3<'+>T淋巴細(xì)胞和CD19<'+>B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。研究表明：Balb/c小鼠比裸鼠對(duì)PCV2更易感，各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)變化與PCV2感染豬只一致，但沒(méi)