胸腺五肽離子交換吸附-納濾-結(jié)晶分離過程的研究.pdf

1、多肽是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質(zhì)，涉及激素、神經(jīng)、細胞生長和生殖等各個領(lǐng)域。多肽在醫(yī)藥中的應(yīng)用已涉及疫苗、抗腫瘤、抗病毒、心血管疾病等在內(nèi)的24類臨床適應(yīng)癥。大量的研究表明，幾乎所有的病毒性疾病和許多疑難疾病都可以用多肽來預(yù)防和治療。多肽藥物巨大的市場前景，刺激了全球各大制藥公司競相加入多肽藥物的研究行列。據(jù)不完全統(tǒng)計，上市的多肽藥物及批準臨床的多肽藥物達到了前所未有的720種?？焖侔l(fā)展的多肽藥物市場，必然要求多肽制造產(chǎn)業(yè)滿

2、足對多肽藥物的大量需求。
　　 多肽的規(guī)模制造技術(shù)包括規(guī)模合成與分離技術(shù)。國內(nèi)的多肽規(guī)模合成技術(shù)，由于近來年的快速發(fā)展，已接近和達到世界先進的技術(shù)水平；但相應(yīng)的多肽規(guī)模分離技術(shù)主要依賴國外的分離技術(shù)與設(shè)備。目前，多肽規(guī)模分離主要依賴制備型反相高效液相色譜，由于其分離介質(zhì)昂貴、設(shè)備投資大、分離手段單一以及不易規(guī)模分離等問題，使規(guī)模分離成為多肽藥物高生產(chǎn)成本的主要原因之一，進而造成昂貴的藥品售價，限制了多肽藥物的廣泛應(yīng)用。
　

3、　 本文旨在探索合成小分子多肽分離過程的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，由于合成小分子多肽的分子量遠小于蛋白質(zhì)等生物大分子的分子量，從幾百到幾千，而蛋白質(zhì)的分子量往往大到幾萬以上，相差幾個數(shù)量級。其次，由于合成小分子多肽不存在類似生物大分子復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)以維持其活性，基本以線性的形式存在。再次，合成小分子多肽在理化性質(zhì)上，與生物小分子物質(zhì)(如氨基酸、核苷酸等)相似，可采用類似氨基酸或核苷酸等的生物小分子分離方法分離合成小分子多肽。因此，基于生物小分子分

4、離的思想，構(gòu)建離子交換吸附－納濾－結(jié)晶的合成小分子多肽新分離過程。
　　 本文以胸腺五肽(TP5)作為合成小分子多肽的代表，從方法學的角度，研究合成小分子多肽新分離過程的共性關(guān)鍵技術(shù)，其主要研究結(jié)果如下：
　　 1.從pH對TP5及共存組分所帶電荷的影響、TP5等電點、疏水性質(zhì)以及穩(wěn)定性等方面入手，研究TP5基本理化性質(zhì)。根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程，計算pH對TP5電荷的影響，當pH小于5時，胸腺

5、五肽含有3個正電荷；當pH大于11時，胸腺五肽含有3個負電荷；TP5的計算等電點為8.64，實測等電點為8.93，疏水性質(zhì)logP值為－1.25。TP5在pH值為2.0～7.0范圍，24小時內(nèi)，均保持較好的穩(wěn)定性。利用量子化學的計算方法，采用MM2與PM3對TP5構(gòu)型初步優(yōu)化，對TP5的分子體積、表面積、分子長度、平均半徑等幾何參數(shù)進行分析。結(jié)果表明，從理論上可以采用凝膠型陽離子交換樹脂實現(xiàn)對TP5吸附分離，同時為陽離子交換樹脂的制備提

6、供設(shè)計參數(shù)。
　　 2.基于葡聚糖凝膠分離介質(zhì)的TP5常規(guī)分離方法。離子交換色譜的分離條件為：葡聚糖凝膠樹脂為SP sepharose FF，緩沖溶液為醋酸緩沖溶液(pH4.4)，洗脫梯度為：0-40％B，10 mL；40％B，10 mL；40％－100％B，10 mL。低壓反相色譜的分離條件為：色譜填料為MKF-RP；流動相：A相為1.2％HAc溶液，B相為乙醇；洗脫流速為1mL/min；洗脫梯度為5％-20％B in30mi

7、n。TP5的總回收率可達80％以上，純度可達98％以上。
　　 3.基于聚苯乙烯-二乙烯苯分離介質(zhì)的TP5離子交換吸附研究，靜態(tài)篩選出NH-1樹脂較適合于分離TP5，常溫條件下，最大吸附容量可達228.83mgTP5/g濕樹脂。TP5與NH-1樹脂之間的離子交換過程符合Langmuir等溫吸附過程，該過程吸附自由能變△G<0，是熱力學有利的過程。TP5與NH-1樹脂之間的離子交換過程受顆粒擴散控制，應(yīng)用Nernst-Planck

8、和Fick動力學模型，得到TP5的顆粒內(nèi)擴散系數(shù)和有效擴散系數(shù)，并可用Fick動力學模型描述TP5在NH-1樹脂內(nèi)的擴散行為。對離子交換動態(tài)柱行為的研究，確定了優(yōu)化的吸附、洗脫與洗雜條件：溶液pH為2.0左右，濃度為10mg/mL，流速為0.1mL/min，高徑比為8:1，0.05mol/L氨水溶液為洗脫溶液，0.1mol/L氯化銨溶液和0.3mol/L氯化鈉溶液為洗雜條件。TP5的回收率可達90.5％，純度為96.6％。對TP5的離子

9、交換柱行為進行數(shù)學模擬，考慮了顆粒擴散、軸向返混、Langmuir非線性平衡以及液膜擴散的影響，該柱行為數(shù)學模型較好地描述了TP5在NH-1樹脂上的動態(tài)柱行為。
　　 4.TP5納濾的研究，選擇SPT-100-150納濾膜可完全截留TP5，較適合于TP5洗脫液的濃縮脫鹽過程，采用濃縮-稀釋-濃縮的間歇納濾操作方式，可實現(xiàn)TP5洗脫液中小分子氨的去除率達到96％以上，TP5濃縮3.2倍；并對該間歇納濾過程進行了數(shù)學模擬。
　

10、　 5.TP5結(jié)晶的研究，探索了醇析與鹽析協(xié)同作用的低溫結(jié)晶體系，實現(xiàn)了TP5的結(jié)晶。結(jié)晶熱力學研究了不同溫度下TP5在該結(jié)晶體系的溶解度，并用λh方程回歸了溶解度數(shù)據(jù)，并構(gòu)建立了模型參數(shù)λ和h與乙醇質(zhì)量分數(shù)之間的經(jīng)驗關(guān)聯(lián)式；同時，測定了該體系在不同溫度下的介穩(wěn)區(qū)。根據(jù)TP5結(jié)晶狀況，選擇了粒度無關(guān)生長模型來描述TP5結(jié)晶過程，TP5晶體的生長動力學方程為G=3.0×10-3△C4.08，其生長過程是螺旋錯位生長；TP5晶體成核動力學

11、方程為B0=0.155△C3.12。對TP5結(jié)晶工藝進行優(yōu)化，確定了結(jié)晶條件為：TP5溶液的pH值為9.0；乙醇加入量為90％(v/v)；TP5的濃度為40mg/mL；氯化鈉的鹽濃度為0.5 mol/L；結(jié)晶控制溫度為4℃。
　　 6.新分離過程與常規(guī)分離方法的對比，采用新分離過程，TP5總回收率達到70％左右；經(jīng)真空干燥后，TP5呈現(xiàn)針狀晶體，純度達到99％。新分離過程的優(yōu)勢之處在于大幅度降低合成多肽的分離成本及設(shè)備投資，每克