大腸桿菌穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子的篩選及pSP表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、當(dāng)培養(yǎng)的大腸桿菌由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，與生長(zhǎng)相關(guān)的基因便停止表達(dá)，而且同時(shí)一些穩(wěn)定期特異性的基因開(kāi)始表達(dá)，啟動(dòng)這些基因表達(dá)的啟動(dòng)子應(yīng)具有一定的穩(wěn)定期特異性。如果能分離出這些啟動(dòng)子中啟動(dòng)能力及穩(wěn)定期特異性較強(qiáng)的啟動(dòng)子并構(gòu)建成相應(yīng)的表達(dá)載體，那么使用這些載體進(jìn)行外源基因的表達(dá)時(shí)，載體自身便具有了特異性的穩(wěn)定期啟動(dòng)表達(dá)的能力。從而無(wú)需測(cè)量菌液的OD來(lái)判斷菌體生長(zhǎng)何時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期，而且也無(wú)需像使用pET表達(dá)系統(tǒng)時(shí)添加IPTG等誘導(dǎo)物來(lái)啟動(dòng)表達(dá)

2、，載體本身將自主控制進(jìn)入穩(wěn)定期后自動(dòng)表達(dá)。 為了分析大腸桿菌K12株中有哪些基因是進(jìn)入穩(wěn)定期才啟動(dòng)表達(dá)的，利用DNA芯片技術(shù)分析了JM109和BL21兩種菌株中三個(gè)不同生長(zhǎng)階段各種基因表達(dá)量的變化情況，解析出進(jìn)入穩(wěn)定期后表達(dá)量上調(diào)的基因。 為了深入了解穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子的強(qiáng)度及特異性，結(jié)合RegulonDB等網(wǎng)站上預(yù)測(cè)的大腸桿菌啟動(dòng)子序列，分離了上述基因中20個(gè)基因起始密碼子上游500bp左右的DNA片段。為了檢測(cè)各種啟

3、動(dòng)子的強(qiáng)度及特異性，構(gòu)建了帶有β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)報(bào)告基因的報(bào)告系統(tǒng)。通過(guò)該報(bào)告系統(tǒng)，在底物(ONPG)，作用下檢測(cè)β-半乳糖苷酶表達(dá)量以及是否為穩(wěn)定期特異性表達(dá)，其中共有4個(gè)啟動(dòng)子具有明顯的穩(wěn)定期特異性的啟動(dòng)功能。 為了進(jìn)一步優(yōu)化分離得到的啟動(dòng)子的表達(dá)效果，構(gòu)建了pSP系列表達(dá)載體。該系列載體中帶有Amp<'R>及Tet<'R>兩種抗性基因；在啟動(dòng)子上游插入了終止子來(lái)抑制本底表達(dá)；增加了H-N標(biāo)簽以