多潛能C3H-10T1-2細胞增殖、分化相關新基因的捕獲、克隆及功能研究.pdf

1、本課題擬以10T1/2細胞為間充質干細胞模型,重點研究基因捕獲技術捕獲的在MSCs有轉錄活性的基因,并以TGF-β1為細胞分化誘導因子,研究MSCs的增殖、多向分化及相關機制,豐富MSCs促進創(chuàng)傷愈合的理論基礎。本研究獲得的主要結果和結論如下:
　　 1.C3H/10T1/2細胞表型鑒定及多向分化的實驗研究
　　 通過流式細胞儀鑒定10T1/2細胞不表達內皮細胞表面抗原CD31,造血干細胞表面抗原CD34,造血細胞表面抗

2、原CD45,但表達CD44、CD73、CD90、CD105等干細胞表面抗原。用TGF-β1誘導10T1/2細胞向平滑肌分化,24 h后誘導細胞出現(xiàn)平滑肌細胞特征性的“峰谷”樣生長外觀,RT-PCR證實αSMA、SM22a、SM-MHC、SRF等平滑肌分化相關基因表達增強,免疫熒光實驗證實α SMA蛋白表達增強,Western blot證實α SMA、SM22a蛋白表達增強,說明成功建立TGF-β1誘導10T1/2細胞平滑肌分化模型。用V

3、EGF和bFGF聯(lián)合誘導10T1/2細胞成內皮分化,9天后誘導細胞出現(xiàn)內皮細胞特征性“鵝卵石”樣外觀,RT-PCR發(fā)現(xiàn)內皮分化相關基因Fit1、Flk1、Ang2、Tie2、VE-cadherin、CD31、Ang1、Vezf1、Notch1、Jagged1和EphB4/EphrinB2誘導后表達逐漸增強,但不表達淋巴內皮細胞標志Flt4,說明誘導后細胞不是淋巴內皮細胞。免疫細胞熒光染色顯示誘導后細胞表達內皮細胞特異性標志CD31、Fa

4、ctorⅧ和VE-cadherin。透射電鏡下觀察誘導后細胞胞漿存在Weibel-Palade小體和豐富的胞飲小泡。Dil-ac-LDL吞噬實驗表明分化后細胞具有吞噬ac-LDL的功能,Ⅰ型膠原三維成血管實驗顯示分化后細胞在體外三維培養(yǎng)中能形成血管樣結構,說明誘導后細胞不但表達內皮細胞標志且具有內皮細胞功能。三維成血管后α SMA/CD31免疫熒光雙標實驗顯示10T1/2細胞自身表達中等強度α SMA,但在分化誘導后表達逐漸降低,而CD

5、31表達逐漸增強,說明VEGF和bFGF聯(lián)合誘導10T1/2細胞成內皮分化時并不存在同時向平滑肌分化的現(xiàn)象。用5-氮雜胞苷誘導10T1/2細胞17天后可見粗大肌管形成,但此誘導并非特異性誘導,誘導15天后少量細胞出現(xiàn)了微小脂滴,并逐步融合變大,25天后形成典型的脂肪細胞,油紅染色可見脂滴。用維生素C、β-磷酸甘油、地塞米松誘導10T1/2細胞成骨分化,第21天茜素紅染色可見紅色骨結節(jié)。用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素誘導1

6、0T1/2細胞成脂分化,第15天油紅染色可見脂滴。用bFGF、β-巰基乙醇、二甲基亞砜誘導10T1/2細胞成神經元分化,第3天出現(xiàn)類似神經元樣細胞,15天時免疫細胞化學檢測神經元標志物神經元特異性烯醇化酶仍為陽性,說明誘導后細胞為神經元樣細胞。體外培養(yǎng)貼壁生長、細胞表面抗原鑒定及有多向分化的潛能說明10T1/2細胞是良好的間充質干細胞模型。
　　 2.多用途基因捕獲C3H/10T1/2細胞陽性克隆庫的建立及鑒定
　　 用

7、含LacZ為報告基因的PolyA基因捕獲載體ROSAFARY轉染包裝細胞Phoenix,收集病毒上清,感染10T1/2細胞,并以潮霉素篩選整合了基因捕獲載體的陽性細胞克隆。測試不同濃度潮霉素對10T1/2細胞的毒性,以7天殺死全部細胞確立潮霉素對10T1/2的最佳篩選濃度為150 mg/l。以150 mg/l潮霉素篩選共獲得103個克隆,經以插入載體ROSAFARY的LacZ為目的基因的細胞基因組DNA PCR及LacZ染色鑒定最終建立

8、了含64個不同克隆的10T1/2細胞基因捕獲陽性克隆庫,其中6個LacZ染色陽性,說明捕獲到部分干細胞中高表達的基因,其余細胞克隆LacZ染色呈陰性,說明捕獲的是干細胞低或不表達的基因。
　　 3.TGF-β1誘導后表達下調捕獲基因的分離及生物信息學分析
　　 TGF-β1誘導前期建立的10T1/2細胞基因捕獲陽性克隆庫平滑肌分化,對分化前后的細胞進行LacZ染色篩選獲得3個平滑肌分化后表達下調克隆,通過RACE等分子生

9、物學技術及電子克隆分離獲得差異表達序列,使用GenBank網站nblast進行生物信息學分析,結果表明為一個已知基因Mrps6和兩個新基因。Mgt-6位于14號染色體,包括4個轉錄本,翻譯2個蛋白質,用GenBank網站在線投遞軟件BankIt提交后獲ID號,轉錄本1、2和3含3個外顯子,編碼短蛋白,用pI/Mw批量計算軟件計算蛋白分子量為1414.68,等電點為5.75,轉錄本4含2個外顯子,編碼長蛋白,計算其分子量為4073.57,

10、等電點為6.52。Mgt-16基因位于19號染色體,含2個外顯子,編碼一個93個氨基酸的蛋白,計算其分子量為9772.02,等電點為6.04,提交GenBank網站獲ID號。最后提取6、16號基因捕獲克隆RNA進行RT-PCR后測序驗證了捕獲載體ROSAFARY插入在mgt-6、mgt-16第一個內含子中,并獲取ROSAFARY載體精確的剪接受體位點在其2754nt處。
　　 4.新基因mgt-16的克隆及功能研究
　　

11、 以逆轉錄病毒載體pL-EGFP-N1為基礎經測序證實成功構建mgt-16融合EGFP的過表達載體pL-EGFP-N1-16,轉染包裝細胞Phoenix后收集病毒感染10T1/2細胞,以400μg/ml G418篩選建立了穩(wěn)定表達mgt-16融合EGFP的細胞克隆,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光只出現(xiàn)在胞漿,證實MGT-16蛋白在細胞胞漿表達,與16號克隆正常培養(yǎng)下LacZ染色結果一致。
　　 以載體pL-EGFP-N1和pIRES2

12、-EGFP-N1為基礎經測序證實成功構建含內核糖體插入序列逆轉錄病毒載體pL-IRES-EGFP-N1,再以pL-IRES-EGFP-N1為基礎成功構建mgt-16融合6×His標簽的逆轉錄病毒載體pL-IRES-EGFP-16-His,轉染包裝細胞Phoenix后收集病毒感染10T1/2細胞,400μg/mlG418篩選獲得mgt-16融合6×His且?guī)RES-EGFP的穩(wěn)定表達克隆。以pL-IRES-EGFP-N1感染的10T1/

13、2細胞為對照,GAPDH為內參,Western blot檢測平滑肌分化相關基因αSMA和SM22a,結果表明過表達mgt-16可抑制TGF-β1誘導的10T1/2細胞平滑肌分化相關基因的表達。
　　 細胞劃痕實驗結果顯示:16號克隆24 h細胞傷口愈合面積百分率較正常10T1/2細胞低,說明mgt-16基因被打斷后可使細胞遷移減慢;而無論是mgt-16融合EGFP還是mgt-16融合His的過表達10T1/2細胞24 h細胞傷口

14、愈合面積百分率均比其對照組高,說明mgt-16基因過表達后可使細胞遷移加快。通過比較mgt-16基因低表達和過表達兩種細胞模型的效應差異,均表明mgt-16基因為細胞增殖、遷移正相關基因。
　　 5.TGF-β1下調,mgt-16表達參與平滑肌分化的分子機制
　　 16號克隆用TGF-β1、p38/RK抑制劑、PI3K/AKT抑制劑、ERK抑制劑、mTOR抑制劑、NF-κB抑制劑,以及單一抑制劑聯(lián)合TGF-β1處理24

15、h,LacZ染色及RT-PCR結果均表明TGF-β1是通過激活P38信號通路引起mgt-16表達降低。接著我們發(fā)現(xiàn):①p38抑制劑可抑制TGF-β1對細胞形態(tài)學的影響;②Western blot檢測TGF-β1可使P38磷酸化蛋白增加及SB203580可抑制此效應;③RT-PCR證實SB203580可抑制TGF-β1誘導的平滑肌分化相關基因SM22a的表達。此三點表明TGF-β1通過激活P38信號通路誘導10T1/2細胞平滑肌分化。至此

16、,提出假說:TGF-β1可能通過激活P38信號通路下調mgt-16基因而調控10T1/2細胞平滑肌分化。
　　 6.新基因mgt-6的克隆及功能研究
　　 6號克隆正常培養(yǎng)及5-氮雜胞苷處理后LacZ染色均顯示正常情況下mgt-6在細胞胞漿表達,而5-氮雜胞苷處理后可發(fā)生核轉位,并由構建mgt-6融合EGFP的真核表達載體pEGFP-N1-6轉染10T1/2細胞觀察綠色熒光亞細胞定位所證實,提示新基因mgt-6可能參與了

17、細胞DNA低甲基化效應。此外,RT-PCR結果表明mgt-6含四個轉錄本且在小鼠不同組織及不同細胞系有不同表達。皮膚、脾、小腸、腎臟、心臟和骨骼肌主要表達轉錄本4,而肝臟主要表達轉錄本1,腦和肺臟4個轉錄本均有較強表達。C2C12主要表達轉錄本4,而10T1/2細胞和Lewis細胞4個轉錄本均有較強表達且轉錄本1、2、4在Lewis細胞表達較10T1/2細胞表達要高。小鼠骨骼肌成肌細胞系C2C12和成年小鼠骨骼肌組織均主要表達轉錄本4而

18、弱表達轉錄本1、2、3,提示MGT-6L或MGT-6S可能與骨骼肌形成或分化有關。6號克隆正常培養(yǎng)、TGF-β1、p38/RK抑制劑、PI3K/AKT抑制劑、ERK抑制劑處理24 h后LacZ染色以及10T1/2細胞正常培養(yǎng)、TGF-β1及不同抑制劑處理24 h后RT-PCR,結果均表明TGF-β1及PD98059處理可使mgt-6表達下調,而SB203580及LY294002處理可使mgt-6表達上調,提示mgt-6可能與平滑肌分化有