蛇毒類凝血酶的純化與基因篩選.pdf

1、研究目的：
　　血管損傷性止血在臨床上占有很大比例。蛇毒酶制劑作為臨床用藥與同類其它制劑相比,其效果優(yōu)良,無嚴重的副作用,使用安全,在臨床治療上有很好的發(fā)展前景。國內(nèi)關于蛇毒類凝血酶酶的研究和利用有很多報道,但是真正具有國內(nèi)知識產(chǎn)權(quán)的止血用蛋白質(zhì)還沒有,同時也存在蛇毒原料的限制。在過去8年里,我們發(fā)現(xiàn)了一個新的止血蛋白Agacutase,其含量非常低,因此,本課題對尖吻蝮蛇蛇毒的止血類凝血酶進行分離純化和基因篩選,通過基因重組生產(chǎn)

2、,降低生產(chǎn)成本和促進產(chǎn)品升級打下了基礎。
　　研究方法：
　　本研究自尖吻蝮蛇蛇毒純化一種新的具有凝血活性的類凝血酶 Agacutase。通過用Sephadex G-75凝膠層析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-25凝膠脫鹽分離純化,根據(jù)核酸蛋白檢測儀在 A280的檢測值大小,收集不同組分。用SDS-PAGE、HPLC檢驗其純度,用質(zhì)譜(MS)和凝血活性方法,對其分子量和對

3、底物酶解活性進行分析。
　　在設計上游引物時,我們根據(jù)純化得到Agacutase的蛋白測序知道的前44位氨基酸序列來設計簡并引物。運用M13(-48)作下游引物,是為了在逆轉(zhuǎn)錄反應時在oligo dT前面加上一段便于測序的基因,以蛇毒腺總RNA為模板,用RT-PCR方法擴增其中的類凝血酶基因序列,膠回收條帶并克隆至T載體上,通過雙向測序得到篩選類凝血酶基因目的。通過用美國NCBI數(shù)據(jù)庫對克隆的蛇毒基因進行同源性分析研究,以獲得初步

4、的功能信息。
　　研究結(jié)果：
　　通過對蛇毒干粉進行多步分離純化后,用HPLC檢測其純度在90％以上,SDS-PAGE電泳結(jié)果為只有單一條帶,基體輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測結(jié)果分子量為31084 Da。纖維蛋白原底物分子水解活性顯示,樣品對α亞基逐步水解,在3小時水解達到高峰,而對照組中的豬凝血酶對纖維蛋白原的α亞基和β亞基明顯水解,在1小時達到高峰。并對β亞基的水解速度明顯快于對α亞基的

5、水解速度。
　　通過設計不同長度的簡并引物(I、II、III、IV和V引物),用RT-PCR方法成功擴增出不同大小的片段:I號引物對擴增出1200bp、800bp、600bp三個片段;II號引物對擴增出一個500bp的片段;III號引物對擴增出1500bp和750bp兩個片段;IV號引物對擴增出一個750bp的片段;V號引物對擴增出1200bp和750bp兩個片段。PCR產(chǎn)物克隆于T載體后,挑取陽性克隆,測序得到六種類凝血酶基因(

6、基因-I、III、VI、VII、VIII和IX)。
　　通過NCBI的BLAST比對后,發(fā)現(xiàn)它們分別與以下蛋白酶的氨基酸序列具有一定同源性:基因-I與蛇毒金屬蛋白酶(snake venom metalloproteinase)有最大同源性為50%,后者具有水解纖維蛋白原的α鏈功能;基因-II與活化蛋白激酶C受體(receptor for activated protein kinase C)有最大同源性為21%;基因-III與蛇毒

7、絲氨酸蛋白酶Da-36(snake venom serine protease Da-36)有最大同源性為78%,后應具有裂解纖維蛋白原Aα、Bβ和γ鏈的功能;基因-IV與NADH脫氫酶亞基4(NADH dehydrogenase subunit4)有最大同源性為95%;基因-V與rCG20216有最大同源性為77%;基因-VI與蛇毒絲氨酸蛋白酶Dav-PA(Snake venom serine protease Dav-PA)有最大同

8、源性為80%,可能具有裂解纖維蛋白原Aα和Bβ鏈功能;基因-VII與類凝血酶Acutobin(Thrombin-like enzyme acutobin)有最大同源性為95%,應具有水解纖維蛋白原的α鏈功能;基因-VIII與蛇種Agkistrodon Acutus類凝血酶(venom thrombin-like enzyme)有最大同源性為60%,可能具有裂解纖維蛋白原Aα和 Bβ鏈功能;基因-IX與蛇種Agkistrodon Acut

9、us的金屬蛋白酶Aahiv的A鏈有最大同源性為55%,可能具有蛇毒金屬蛋白酶的功能。
　　研究結(jié)論：
　　通過凝膠過濾層析與離子交換層析等分離純化過程從尖吻蝮蛇蛇毒干粉中得到單一的組分,該組分為一種新的具有止血活性的類凝血酶,并命名為Agacutase。
　　基因篩選實驗發(fā)現(xiàn)了幾種新的蛇毒類凝血酶。根據(jù)DNA序列推導氨基酸序列,通過NCBI的protein BLAST比對后,發(fā)現(xiàn)其中6個與幾種已知序列的類凝血酶的同源性