塔瑪亞歷山大藻對中國對蝦抗病力的影響機理研究.pdf

1、本論文選擇一株能產(chǎn)生麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)的赤潮甲藻塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense, ATHK株)，研究了其對我國北方池塘主要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種—中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)免疫功能和抗病力的影響，探討有毒藻類對養(yǎng)殖對蝦疾病的誘發(fā)機制。研究分為三個部分：
　　第一部分為塔瑪亞歷山大藻對中國對蝦毒性的初步研究。
　

2、　對塔瑪亞歷山大藻ATHK藻株在實驗室培養(yǎng)的條件下生長情況進行了研究；利用美國分析化學家協(xié)會(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)所推薦的小鼠生物法(mouse bioassay, MBA)測定了不同生長時期和不同培養(yǎng)溫度下的塔瑪亞歷山大藻的麻痹性貝毒毒性；采用浸浴方式研究了藻株對中國對蝦的急性毒性；采用 HE染色的方法，分別對在浸浴(1.0×104 cells/mL組)和

3、注射(6.63×104cells/mL組)后96 h的中國對蝦的鰓和肝胰腺石蠟切片進行了觀察。結(jié)果表明，藻株屬中溫株，最適生長溫度為20℃，此溫度下生長率為0.24d-1；在最適生長溫度下培養(yǎng)，藻株單位細胞毒性為1.85×10-5-4.57×10-5 MU/cel1(3.50-8.64 pg STX Equal/cell)，在對數(shù)生長末期達最大值，在同種藻株中屬低毒藻株；單位細胞毒性在本實驗所設(shè)的溫度范圍(16-32℃)內(nèi)隨溫度增加而呈

4、下降趨勢；塔瑪亞歷山大藻對中國對蝦96 h半致死濃度(median lethal concentration, LC50)為1.0×104 cells/mL，安全濃度(safe concentration, SC)為1.0×103 cells/mL；石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)塔瑪亞歷山大藻和其毒素粗提液分別引起了對蝦鰓和肝胰腺出現(xiàn)細胞腫脹、空泡化等病理變化。
　　第二部分為塔瑪亞歷山大藻對中國對蝦鰓和肝胰腺組織SOD、GST、MDA和細胞凋

5、亡的影響
　　塔瑪亞歷山大藻粗提液經(jīng)肌肉注射方式染毒中國對蝦，于染毒后1、3、6、12、24和48 h測定肝胰腺和鰓組織的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)活性和丙二醛(malonyldialdehyde, MDA)含量的影響。采用浸浴方式研究暴露于200 cells/mL和1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻中中

6、國對蝦鰓和肝胰腺的SOD活性、GST活性、MDA含量和Caspase(cysteinylaspartate specific proteinase, Caspase)基因(FcCasp)相對表達量，并對暴露96h后的中國對蝦肝胰腺細胞凋亡情況利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TdT mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法進行了檢測。結(jié)果顯示：注射染毒后1-6 h,對蝦肝胰腺和鰓組織S

7、OD，GST活性均增加，12和48 h鰓組織的上述指標受到抑制(P<0.05)。對蝦肝胰腺MDA含量除1 h外未見明顯改變(P>0.05)，鰓中MDA含量隨時間增加呈升高趨勢。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，中國對蝦鰓SOD活性、GST活性、MDA含量和FcCasp相對表達量均隨著取樣時間推移整體表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，鰓SOD活性隨時間增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在24-

8、96 h被顯著抑制(P<0.05)，鰓GST活性除3和48 h外均被顯著抑制(P<0.05)，MDA含量和FcCasp相對表達量均整體表現(xiàn)上升的趨勢，呈現(xiàn)出一定的時間效應(yīng)。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，肝胰腺SOD活性、GST活性、MDA含量和FcCasp相對表達量除個別時間點外，無顯著改變(P>0.05)。1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，肝胰腺的SOD和GST活性均隨著取樣時間推移整體表現(xiàn)出先上升后下降

9、的趨勢，肝胰腺MDA含量在48-96 h顯著上升(P<0.05)，且在此時間段內(nèi)肝胰腺MDA含量上升的趨勢和其GST活性下降的趨勢相一致。相關(guān)性分析顯示塔瑪亞歷山大藻脅迫下，中國對蝦鰓和肝胰腺的MDA含量和FcCasp相對表達量呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)R2分別為0.8663和0.8606，P<0.05)。TUNEL分析顯示，1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫96 h，中國對蝦的肝胰腺出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。研究表明：塔瑪亞歷山大藻及其毒

10、素對中國對蝦組織具有脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation, LPO)作用，引起MDA含量增加，SOD和GST活性降低。塔瑪亞歷山大藻可造成中國對蝦氧化損傷，從而導致FcCasp表達上調(diào)，誘導細胞凋亡。MDA含量和Caspase基因表達水平呈線性相關(guān)，表明了LPO在誘導細胞凋亡中的作用。中國對蝦鰓組織中SOD活性，GST活性和MDA含量在塔瑪亞歷山大藻濃度高于200 cells/mL對塔瑪亞歷山大藻的變化有積極的響應(yīng)，其隨藻濃

11、度及其作用時間的不同而發(fā)生不同的變化，在作為有毒藻暴露的生物標記物方面有較好的應(yīng)用前景。
　　第三部分為塔瑪亞歷山大藻對中國對蝦免疫相關(guān)基因表達和抗病力的影響。
　　克隆獲得了中國對蝦一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)基因全長序列、分析該基因的特征、檢測了 NOS在對蝦各個組織的表達情況及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(5×106 CFU/mL)刺激下在對蝦鰓

12、和肝胰腺組織的表達情況；并研究了暴露于200和1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻中中國對蝦鰓和肝胰腺NOS基因的表達變化情況及暴露于不同濃度(100,200,500,1000,2000和4000 cells/mL)塔瑪亞歷山大藻后機體抗副溶血弧菌能力；研究了暴露于200和1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻中中國對蝦TLR基因和Relish基因的表達變化情況及抗白斑病毒(white spot syndrome virus, W

13、SSV)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的能力。結(jié)果表明，NOS基因全長4616 bp，包含3582 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個由1193個氨基酸組成的多肽，起始密碼子(ATG)位于164-166位核苷酸，終止密碼子(TAG)位于3743-3745位核苷酸，5′和3′的非編碼區(qū)分別為163 bp和871 bp，含有四個ATTTA基序。NOS推導的氨基酸序列通過SMART進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有從無脊椎動物到脊

14、椎動物都比較保守的多個蛋白家族保守序列，主要包含4個結(jié)構(gòu)域：NO synthase結(jié)構(gòu)域，flavodoxin1結(jié)構(gòu)域，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合域和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)結(jié)合域。中國對蝦NOS蛋白氨基端血紅素(Heme)和四氫葉酸(BH4)結(jié)合位點，羧基端黃素單核苷酸(FMN)、FAD和還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)結(jié)合位點，在脊椎動物三種類型NOS和無脊椎動物間也都高度保守。中國對蝦 NOS與昆蟲 NOS聚

15、為一支，與脊椎動物的組成型NOS進化關(guān)系更近，與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)和日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)的同源性分別為97％和95%。中國對蝦NOS基因在鰓中的表達量最高，其次為肝胰腺。副溶血弧菌注射后中國對蝦鰓和肝胰腺組織 NOS基因在最初階段的表達量都顯著上調(diào)。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，中國對蝦的鰓和肝胰腺的NOS基因表達在實驗初期有所上升，實驗中后期均恢

16、復至對照組的水平，而1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下對蝦鰓和肝胰腺組織的NOS基因表達分別在12 h后和72 h后被顯著抑制(P<0.05)。不同濃度塔瑪亞歷山大藻(100,200,500,1000,2000和4000 cells/mL)暴露6天后的中國對蝦，經(jīng)副溶血弧菌人工急性感染后，中國對蝦的累積死亡率在各時間點整體上呈現(xiàn)隨藻濃度的增加而增加的趨勢，500,1000,2000和4000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅

17、迫組的累積死亡率在24,48和72 h均顯著高于對照組(P<0.05)，而100和200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫組在24,48和72 h的累積死亡率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫72-144 h，中國對蝦的肝胰腺、鰓和血淋巴的TLR和Relish基因表達或被顯著抑制(P<0.05)，或恢復至海水對照組的水平(P>0.05)。而1000 cells/mL藻中對蝦鰓組織和血淋巴

18、的上述基因表達在48-144 h被顯著抑制(P<0.05)，肝胰腺的表達在72-144 h被顯著抑制(P<0.05)。塔瑪亞歷山大藻脅迫下投喂感染W(wǎng)SSV的病蝦后，加藻的感染組(200和1000 cells/mL)和未加藻的感染組的中國對蝦雖然都在第3天時檢測到陽性結(jié)果，7天內(nèi)累積死亡率均為100%，但同一時間點加藻組的累積死亡率高于未加藻組。塔瑪亞歷山大藻脅迫6天后的中國對蝦，經(jīng)鰻弧菌人工急性感染后，200和1000 cells/mL