注射式DBM-HA-TCP復(fù)合材料研究.pdf

1、本研究的目的是研制一種成骨能力優(yōu)良的骨缺損修復(fù)材料，具有優(yōu)良的注射性和可塑性，富含成骨活性成分 DBM，并可為新骨再生提供鈣磷離子成分，降解性-成骨性優(yōu)良，X線下可以顯影，在一定程度上緩解骨源不足的問題。
　　研究分為以下幾個(gè)部分：
　　第一部分球形納米晶HA和TCP的制備與評(píng)價(jià)
　　目的：采用化學(xué)方法合成球形納米晶的 HA/TCP材料。采用成骨細(xì)胞對(duì)材料進(jìn)行細(xì)胞活性評(píng)價(jià)。
　　方法：以 Ca(NO3)2和(NH

2、4)2HPO4為實(shí)驗(yàn)原料，調(diào)節(jié) Ca(NO3)2溶液的 pH值為10-11，(NH4)2HPO4溶液的pH值為9-10；分別按Ca/P為9:5和3:5混勻后，調(diào)節(jié) pH值保持在10-11，25°C振蕩24h；陳化、清洗、干燥。將干燥后的粉體800°C煅燒2h。對(duì)煅燒前后的粉體進(jìn)行XRD和SEM表征，確定物相和形貌以及顆粒大小。培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞，用該細(xì)胞系對(duì)煅燒后的兩種材料進(jìn)行體外細(xì)胞相容性研究，觀察指標(biāo)選擇為細(xì)胞增殖、堿性磷

3、酸酶蛋白表達(dá)水平和功能性成骨指標(biāo)COL-1的基因表達(dá)水平以及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　結(jié)果：對(duì)合成的粉體進(jìn)行XRD測(cè)試，結(jié)果顯示煅燒之前獲得的9:5和3:5 Ca/P兩種前驅(qū)體晶體結(jié)構(gòu)相似，各衍射峰位置均與HA的標(biāo)準(zhǔn)卡相對(duì)應(yīng)，在經(jīng)過800°C燒結(jié)之后，Ca/P=9:5材料為結(jié)晶度理想的HA材料，而Ca/P=3:5材料為具有較高結(jié)晶度的TCP材料。SEM顯示煅燒之前Ca/P為3:5和9:5前驅(qū)體材料均為顆粒直徑為44-248 nm球形納米

4、晶形貌，在形貌上兩者類似。經(jīng)過800°C煅燒得到的HA和TCP依然為納米球形結(jié)構(gòu)。MTT結(jié)果表明，與對(duì)照組相比兩種材料組的細(xì)胞增殖率均明顯升高。其中，TCP對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用優(yōu)于HA（P<0.05）。此外，TCP組堿性磷酸酶的活性明顯高于HA組（P<0.05）。PCR結(jié)果顯示，兩個(gè)材料組表面成骨細(xì)胞均有COL-I的表達(dá)，且表達(dá)量隨時(shí)間遞增，結(jié)果依然是TCP組優(yōu)于HA。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功的利用了傳統(tǒng)化學(xué)濕法合成過程，在特定原料

5、比例、配置混合方法和反應(yīng)條件下，合成出了純度較高的納米羥基磷灰石。煅燒后成功制得球形納米晶的羥基磷灰石和磷酸鈣。經(jīng)成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，具有很好的細(xì)胞相容性，且球形納米晶TCP組材料在細(xì)胞增殖、ALP活性及COL-I基因表達(dá)等方面甚至優(yōu)于相似納米晶的HA，在應(yīng)用中可適當(dāng)增大TCP的用量。
　　第二部分 DBM的制備與活性評(píng)價(jià)
　　目的：制備兔DBM并對(duì)其鈣含量和骨誘導(dǎo)活性進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)研究提供材料基礎(chǔ)。
　　方法：選用健

6、康的6個(gè)月齡的新西蘭長(zhǎng)耳兔10只。將兔處死后，取兔四肢管狀皮質(zhì)骨，去除干骺端及肌肉等軟組織，深低溫-80℃冷凍4周降低抗原性，超聲清洗去脂無雜質(zhì)，凍干后粉碎過篩，取24-50目顆粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將骨粉置入0.5mol/L鹽酸常溫脫鈣24h，純化水多次沖洗至pH為6.0左右。冷凍干燥、密封、25KGy60Co輻照滅菌。即為脫鈣骨基質(zhì)DBM樣品，觀察樣品的外觀變化。取1g樣品，用煮沸的水稀釋20倍，超聲震蕩10分鐘后靜置10分鐘，測(cè)其pH。

7、另取0.5g骨粉和DBM，用濃 HNO3浸泡，電爐高溫消化完全，分別置入100ml容量瓶，定容；利用等離子發(fā)射光譜儀（ICP）檢測(cè)鈣含量。選取10只裸鼠進(jìn)行雙側(cè)實(shí)驗(yàn)，左側(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組兔粉，右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組DBM。用0.3％戊巴比妥鈉麻醉，在小鼠腿部肌間隙分別植入樣品。術(shù)后28天取材，固定，經(jīng)過脫水、包埋、切片等過程，制成標(biāo)本切片，HE染色觀察組織學(xué)反應(yīng)。觀察是否有軟骨樣組織或骨樣組織形成。按照骨誘導(dǎo)活性評(píng)分OI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行活性分級(jí)。
　　結(jié)

8、果：脫鈣后制備的兔 DBM為乳白色，粒徑為150μm-700μm。實(shí)驗(yàn)測(cè)得骨粉和兔DBM的pH分別為6.2±0.5、6.1±0.6，均符合國(guó)家要求（5.8-7.5）。等離子發(fā)射光譜分析法測(cè)量得兔粉即正常兔四肢骨的鈣含量占總重量的21.34-25.34%。DBM鈣含量明顯降低，最少為4.9%。術(shù)后裸鼠，傷口愈合較好，4W觀察發(fā)現(xiàn)，皮膚上無手術(shù)痕跡，肌肉內(nèi)能看到異物，此外少數(shù)肌肉上發(fā)現(xiàn)部分線頭未被吸收完全；X光片影像學(xué)顯示兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組手術(shù)部位

9、中未經(jīng)脫鈣處理的兔粉有明顯的顯影，兔DBM的術(shù)后區(qū)域X線下顯影不明顯；組織學(xué)觀察顯示，植入物周圍無明顯炎癥反應(yīng)；對(duì)照組骨粉植入后4W無明顯的新骨生成，存在大量脂肪細(xì)胞形成的空泡結(jié)構(gòu)，有纖維結(jié)締組織長(zhǎng)入，而DBM組有明顯的新骨和軟骨形成，可見大量成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞以及中央有類骨髓腔結(jié)構(gòu)形成。
　　結(jié)論：利用改進(jìn)的 Urist方法，嚴(yán)格控制制備過程，我們成功得到了兔 DBM，且動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該兔DBM具有骨誘導(dǎo)活性。為后續(xù)復(fù)合材料制

10、備和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了必要的材料基礎(chǔ)。
　　第三部分甘油明膠賦形劑材料的制備與評(píng)價(jià)
　　目的：在臨床手術(shù)中，我們國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的骨顆?；蚍勰┰谑中g(shù)操作中成型性很差。目前已知的生物賦形劑材料均不能耐受60°C輻照滅菌。為解決該類材料終末滅菌的問題，本研究以甘油為溶劑制備出一種可采用輻照滅菌并且易于保存的溶膠-凝膠賦形劑。
　　方法：稱取不同量的明膠于燒杯中,加入適量的水浸泡,待其充分溶脹；將25mL甘油置于70℃的烘箱，加熱30m

11、in后，將明膠與甘油趁熱混合，攪拌均勻；繼續(xù)加熱5min，取出，自然冷卻，除去上層氣泡層；用500μW/m2紫外線照射2 h，放入-20°C冰箱穩(wěn)定72 h，即得不同濃度的甘油明膠基質(zhì)。檢測(cè)各個(gè)基質(zhì)的pH；采用DSC-60型-差熱分析儀對(duì)材料的相轉(zhuǎn)化溫度進(jìn)行測(cè)試；通過安東帕 MCR302高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)基質(zhì)的流變性進(jìn)行檢測(cè)；觀察輻照滅菌4.0%殼聚糖，1.0%透明質(zhì)酸鈉，2.0%海藻酸鈉以及1.0%甘油明膠四種流體粘度和pH的影響；以P

12、BS為模擬體液，將制備的不同濃度明膠含量的基質(zhì)均稀釋10倍，測(cè)各個(gè)基質(zhì)體外溶解速率，每隔2小時(shí)觀察一次；以BALB/c-小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行體內(nèi)植入試驗(yàn)，觀察其術(shù)后1天、3天、7天的組織學(xué)反應(yīng)，HE染色觀察基質(zhì)的生物相容性。
　　結(jié)果：隨著甘油明膠基質(zhì)中明膠濃度的增加，基質(zhì)的pH一直穩(wěn)定在5.60左右。常溫下，當(dāng)明膠含量小于等于2.0%時(shí)，基質(zhì)為可以流動(dòng)的溶膠；當(dāng)明膠含量大于等于2.5%時(shí)，基質(zhì)變?yōu)槟z，不在具有流動(dòng)性，而加熱到一

13、定溫度其有轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂辛鲃?dòng)性的溶膠。從DSC曲線和溫度掃描結(jié)果看相轉(zhuǎn)化在46~50°C。隨明膠濃度的增大，基質(zhì)的模量也在上升，彈性模量從幾十變到1500左右；賦形劑的3ITT測(cè)試發(fā)現(xiàn)50s內(nèi)膠體的粘彈模量值可以恢復(fù)到原來的90%。1.0%透明質(zhì)酸鈉（SH）、4.0%殼聚糖（CS）、2.0%海藻酸鈉（SA），經(jīng)過輻照后除了1.0%溶膠，其他三種賦形劑的粘度值均低于10 Pa·s；而1.0%溶膠的粘度也下降為583 Pa·s；pH值在5.66

14、-7.43變化；輻照前后5.0%凝膠粘性模量幾乎沒有變化，彈性模量略有減低。12h內(nèi)膠體可以完全溶解（24小時(shí)以內(nèi)去除不影響材料的骨誘導(dǎo)活性、細(xì)胞的浸潤(rùn)）；組織學(xué)結(jié)果說明，甘油明膠基質(zhì)具有很好的組織相容性和降解性能。
　　結(jié)論：以甘油為溶劑，研究制備出可以采用輻照方法滅菌的賦形劑。這種溶膠-凝膠基于不同明膠含量的變化可以展現(xiàn)出較大的模量跨度，基于這一點(diǎn)該賦形劑存在廣闊的使用空間?？刹捎?0Co-γ射線輻照滅菌的溶膠-凝膠載體材料，

15、將為復(fù)合制劑的生產(chǎn)工藝提供極大的便利，很大程度上降低了無菌操作設(shè)施和工藝所產(chǎn)生的生產(chǎn)成本和工藝過程風(fēng)險(xiǎn)。鑒于基質(zhì)的穩(wěn)定性和安全性，可以進(jìn)一步擴(kuò)展其在醫(yī)藥和食品工業(yè)上的應(yīng)用。
　　第四部分注射式DBM/HA-TCP復(fù)合材料的制備與評(píng)價(jià)
　　目的：制備注射式DBM/HA-TCP復(fù)合材料，選用兔子骨缺損模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，手術(shù)部位為髂骨，評(píng)價(jià)復(fù)合材料骨缺損修復(fù)的效果，尋求兔 DBM與HA-TCP的優(yōu)化復(fù)合比例。
　　方法：首先將煅

16、燒后的HA和TCP材料按照60:40的比例混合（國(guó)內(nèi)外常用比例為70:30和60:40，本研究選用了較高的TCP比例），充分混合后得到的為雙相磷酸鈣即BCP復(fù)合粉體；將兔的DBM與BCP復(fù)合粉體混合，按照不同DBM和BCP比例分別制備100%DBM、25%BCP、50%BCP、75%BCP、100%BCP五種混合材料；將混合材料與甘油明膠混合均勻，甘油與復(fù)合粉的比例10:8，得到5組樣本，包裝后輻照滅菌。將五種材料進(jìn)行注射性能測(cè)試，并在

17、X線下曝光成像。在兔子的髂骨部位，以環(huán)形鉆于髂骨部位上鉆出直徑約6mm,長(zhǎng)10mm，深度約5mm的洞形缺損，在兔子的左右髂骨各制備3個(gè)，共計(jì)6個(gè)洞形的骨缺損模型，將五組材料分別植入到實(shí)驗(yàn)兔的骨缺損處，并保留一個(gè)空白組作為對(duì)照。術(shù)后連續(xù)注射青霉素5天，分別于4周、8周觀察。采用Micro-CT評(píng)價(jià)局部的骨量和骨質(zhì)變化；熒光標(biāo)記后，于熒光顯微鏡下觀察熒光雙標(biāo)帶之間的寬度差異以計(jì)算成骨速率；此外還要進(jìn)行 VG染色組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果：

18、這五種材料進(jìn)行注射時(shí)的載荷均小于50N，于X線下曝光成像，100%DBM注射材料幾乎不顯影，隨著HA和TCP復(fù)合無機(jī)粉體的加入，注射式復(fù)合材料的顯影密度逐漸增加。術(shù)后，部分動(dòng)物手術(shù)部位出現(xiàn)不同程度腫脹，約2周后消失。根據(jù)Micro-CT結(jié)果推測(cè)，8W時(shí)除空白組外其余各組手術(shù)部位的恢復(fù)狀態(tài)良好，中央有不同程度的缺損區(qū)域。在熒光顯微鏡下各標(biāo)本中均可見黃綠色標(biāo)記，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的新骨小梁生長(zhǎng)都比較旺盛，75%BCP組礦化沉積率最高。VG組織學(xué)觀察