改良HBV型特異性引物PCR基因分型方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、我國(guó)是乙型肝炎病毒(HBV)感染高發(fā)區(qū)，乙型病毒性肝炎嚴(yán)重威脅人類的生命健康。依據(jù)HBV全基因組序列同源性≥92％或S基因序列同源性≥96％將HBV分為了A-H 8種基因型。HBV的基因型是由長(zhǎng)期病毒突變和宿主的篩選累積形成的結(jié)果。目前的研究顯示，不同基因型HBV在流行病學(xué)特征、病毒變異、疾病表現(xiàn)和治療應(yīng)答等方面均存在著差異， HBV 的基因分型研究對(duì)進(jìn)一步明確乙型肝炎發(fā)病機(jī)理、提高檢測(cè)效率、尋找治療對(duì)策和實(shí)現(xiàn)流行病學(xué)控制具有重要意義。

2、現(xiàn)有的HBV基因分型檢測(cè)方法主要有測(cè)序分型法、型特異性引物PCR基因分型法、PCR-RFLP分型法和單克隆抗體ELISA分型法等。其中，型特異性引物PCR基因分型法是一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的分型方法，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。型特異性堿基是該分型方法特異性的保證，由于HBV及其基因型的流行具有顯著的地域差異性，不同地域HBV基因組上型特異性堿基的分布情況以及不同地域相同基因型HBV的相同型特異性堿基位點(diǎn)的特異度也可能存在差異，因此，直接將國(guó)外現(xiàn)

3、有的型特異性引物PCR基因分型法在國(guó)內(nèi)應(yīng)用缺乏科學(xué)依據(jù)，評(píng)估型特異性引物的設(shè)計(jì)合理性以及所建立分型體系的地域適用性顯得相當(dāng)重要。但目前尚缺乏系統(tǒng)、有效的型特異性引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)與評(píng)估體系，所以改良現(xiàn)有型特異性引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)以及評(píng)估體系，明確分型系統(tǒng)的適用地域，建立一套靈敏、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、國(guó)內(nèi)適用的改良HBV型特異性引物PCR基因分型體系對(duì)于國(guó)內(nèi)HBV基因型的相關(guān)研究具有重要意義。 目的：本研究旨在改進(jìn)現(xiàn)有型特異性引物PCR基因分型

4、法的引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)與方法評(píng)估體系，明確方法的適用地域，建立一種靈敏、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、國(guó)內(nèi)適用的改良HBV型特異性引物PCR基因分型法。 方法： 1、改良HBV B、C基因型型特異性引物PCR分型法的建立：自GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集已明確基因型的HBV全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列，設(shè)立型特異性堿基相關(guān)的定義與判斷標(biāo)準(zhǔn)，利用DNAman軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，得到各型HBV S 基因上的所有型特異性堿基，尋找型特異性堿基聚集區(qū)，在聚

5、集區(qū)上設(shè)計(jì)型特異性引物，利用標(biāo)準(zhǔn)B、C基因型HBV血清作為陽(yáng)性模板初步建立B、C基因型HBV型特異性引物PCR基因分型法。開展方法學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，包括PCR反應(yīng)條件優(yōu)化、靈敏度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和特異性實(shí)驗(yàn)。利用22例臨床樣品，將該法與HBV基因分型“金標(biāo)準(zhǔn)”方法測(cè)序分型法進(jìn)行方法比對(duì)，同時(shí)利用血清樣品測(cè)序結(jié)果對(duì)本法進(jìn)行方法學(xué)設(shè)計(jì)評(píng)估。 2、兩套HBV型特異性引物分型體系的比較：依據(jù)參考文獻(xiàn)提供的型特異性分型引物建立經(jīng)典型特異性引物P

6、CR基因分型法(以下簡(jiǎn)稱“經(jīng)典法”)。利用22例臨床樣品，將經(jīng)典法與改良型特異性引物PCR基因分型法(以下簡(jiǎn)稱“改良法”)進(jìn)行方法學(xué)設(shè)計(jì)和性能的比對(duì)。 3、改良HBV型特異性引物PCR基因分型法的初步應(yīng)用：利用改良型特異性引物：PCR基因分型法對(duì)187例廣東省內(nèi)HBV DNA陽(yáng)性的慢性乙型肝炎病人血清進(jìn)行分型檢測(cè)。 結(jié)果： 1、利用B基因型HBV S基因上的型特異性堿基(nt321 A，nt324T，nt330

7、G)和C基因型HBV S基因上的型特異性堿基(nt293 A，nt294C，nt300 C)成功建立了改良HBV B、C基因型特異性引物PCR分型法。檢測(cè)比對(duì)血清盤，改良法與測(cè)序分型法的檢測(cè)符合率為100％。國(guó)內(nèi)B基因型HBV S 基因上型特異性堿基的分布情況和堿基特異性指標(biāo)與由收集的標(biāo)準(zhǔn)序列分析得到的B基因型特異性堿基分布情況和堿基特異性指標(biāo)存在顯著性差異(P≤0.05)，而C基因型無顯著性差異(P≥0.05)。 2、檢測(cè)比對(duì)

8、血清盤，改良法與對(duì)照法的結(jié)果符合率為86％。 3、收集自廣東省的187份慢性乙型肝炎病人血清中，改良法成功分型185例、2例擴(kuò)增未檢出。185例已分型樣品中B型107例(57.2％)、C型70例(37.4％)、BC混合型8例(4.3％)。 結(jié)論： 本研究成功建立了一種改良HBV型特異性引物PCR基因分型方法，其具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、國(guó)內(nèi)適用等特點(diǎn)。本改良方法并被初步應(yīng)用于廣東省內(nèi)HBV基因型流行情況的調(diào)查。