氯氰菊酯和氟氯苯氰菊酯免疫分析化學(xué)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以氯氰菊酯和氟氯苯氰菊酯為研究對(duì)象，合成了氯氰菊酯半抗原Cyp-Hp<,1>和氟氯苯氰菊酯半抗原Flu-Hp<,2>。采用活性酯法將半抗原與載體蛋白BSA和OVA共價(jià)偶聯(lián)，制備人工抗原，經(jīng)紫外分析確定偶聯(lián)成功，以Cyp-Hp<,1>-BSA和Flu-Hp<,2>-BSA為免疫原免疫新西蘭白兔，分別獲得了針對(duì)氯氰菊酯和氟氯苯氰菊酯的特異性抗血清。間接ELISA法測(cè)定抗血清的中點(diǎn)效價(jià)為1.6×10<'4>，雙向瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抗血清的效

2、價(jià)為1/16。以硫酸銨分步鹽析法分離抗血清中的抗體并凍干得抗氯氰菊酯抗體Abl和抗氟氯苯氰菊酯抗體Ab<,2>。分別用活性酯法和混合酸酐法制備了酶標(biāo)半抗原(Cyp-Hp<,1>-HRP和Flu-Hp<,2>-HRP)，酶標(biāo)記物既保持了免疫化學(xué)特性，又保持了酶活性，可用于免疫化學(xué)分析。 進(jìn)一步研究了pH值、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑在包被抗體-酶標(biāo)半抗原(E-H)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA中對(duì)氯氰菊酯與Abl親和作用的影響。結(jié)果表明：包被介質(zhì)pH

3、為7.2時(shí)，固相載體對(duì)Ab<,1>的吸附性最好；反應(yīng)介質(zhì)pH為7.0時(shí)，Ab<,1>與氯氰菊酯的親和作用最強(qiáng)；離子強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)增大會(huì)提高Ab<,1>與氯氰菊酯的親和力；乙腈和丙酮對(duì)氯氰菊酯免疫分析結(jié)果的影響要大于甲醇。 成功建立了氯氰菊酯直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法。方陣試驗(yàn)確定了Ab<,1>最佳包被濃度為6μg/mL，酶標(biāo)半抗原(Cyp-Hp<,1>-HRP)最佳稀釋度為64000倍。在優(yōu)化條件下，建立了氯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲

4、線，回歸方程I=0.1919LogC+0.5618，R<'2>=0.9913，線性范圍為100～0.01μg/mL，抑制中濃度IC<,50>=0.461μg/mL，IC<,20>=12ng/mL，RSD=17.26％(n=5)。 在空白青菜樣品中分別添加氯氰菊酯標(biāo)樣，使樣品中氯氰菊酯的含量分別為0.5 mg/kg和5mg/kg兩個(gè)水平。添加樣品用丙酮提取，E-H直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定，重復(fù)5次。氯氰菊酯添加濃度為0.5mg/k

5、g水平時(shí)，回收率80.29％～89.20％，RSD為 4.35％；氯氰菊酯添加濃度5mg/kg水平時(shí)，回收率89.68％～120.78％，RSD為11.88％。說(shuō)明E-H直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法能滿足氯氰菊酯殘留分析的要求。 成功建立了氟氯苯氰菊酯直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法。方陣試驗(yàn)確定了Ab<,2>最佳包被濃度為6μg/mL，酶標(biāo)半抗原(Flu-Hp<,2>-HRP)最佳稀釋度為384000倍。建立了氟氯苯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，回