結直腸癌電子表達譜的生物信息學分析及差異表達基因研究.pdf

1、結直腸癌是嚴重危害我國人民健康的常見病,其發(fā)病率近年上升趨勢明顯.盡管結直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制取得一定進展,仍有許多已知或未知的基因有待于進一步探索.隨著人類基因組計劃、單體型計劃和癌癥基因組解剖計劃等大規(guī)模測序項目的完成,公共數據庫積累了大量的基因組序列信息.表達序列標簽(expressed sequencetag,EST) 是 cDNA.單次測序結果,是尋找基因的重要方法.挖掘公共 EST 數據庫(database of EST,

2、dbEST),將為我們的研究帶來新思路.本文從 dbEST 獲取結直腸正常、炎癥性腸病、腺瘤和腺癌等相關EST,利用 dbEST和 UniGene 數據庫的序列注釋特征,開發(fā)生物信息學軟件GetUni,成功實現了從EST到UniGene的聚類,構建結直腸正常(N)、炎癥性腸病(IBD)、腺瘤(A)和腺癌(T)四個電子文庫,各文庫分別包含4375、3451、875和200608個UniGene,4108、2230、606和18891個非冗

3、余 UniGene,及4108、2201、592和14879個基因.美國癌癥研究所 (National Cancer Institute,NCI) 結直腸正常及癌組織cDNA文庫Xprofiler交叉驗證GetUni的轉化效率.電子文庫間的直接比對以及基于 Gene Ontology 的生物信息學分析發(fā)現:除bA9F11.1 (Hs.329040)外,T文庫包括了N、IBD和A等3個文庫的全部基因.T文庫每個基因平均含1.27個轉錄子,

4、顯著高于其它三個文庫(p<0.01).生物信息學分析發(fā)現50條信號通路在文庫間富集程度差異有統(tǒng)計學顯著性(p<0.01),核糖體蛋白基因與糖酵解/糖異生通路基因在文庫A和IBD相對富集,整合素信號通路基因在N和IBD相對富集,七次跨膜受體(rhodopsin family)家族則在T文庫相對富集.Q-PCR檢測結果發(fā)現,RPS2、RPS12、RPS27a、RPL7a、RPL5和RPL10等6個核糖體蛋白基因分別有5例、6例、3例、5例、

5、2例和3例腺瘤表達相對正常表達增高,21例、18例、17例、14例、21例和13例結直腸癌表達相對增高.但各基因在正常、腺瘤和腺癌等不同組織之間的表達水平差異未發(fā)現有顯著統(tǒng)計學意義(p>0.05).系統(tǒng)聚類把腺瘤、結直腸癌分成核糖體蛋白基因富集程度較高的A組和相對較低的B組,各有25例(腺瘤7例)和23例(腺瘤1例)結直腸腫瘤,提示腺瘸核糖體蛋白基因富集程度顯著高于結直腸癌(87.5﹪,7/8例腺瘤vs 45﹪,18/40例結直腸癌),

6、差異有統(tǒng)計學意義(p=0.020). 在結直腸組織電子表達譜生物信息學分析的基礎上,選取95個基因構建整合TaqMan定量PCR和微流體技術的低密度芯片(Low density array,LDA),進行高通量定量PCR研究.這些基因大多與結直腸正常粘膜上皮分化關系密切,包括Wnt、TGFβ/BMP4、Hegehog和Notch等四條信號通路、Polycomb Group(PeG)基因家族及其它細胞分化發(fā)育相關基因.96個基因

7、(含GAPDH)中,僅DAAM1未見有效擴增信號.26例結直腸癌配對組織(包括27個癌、7個腺瘤及配對正常組織)LDA檢測總體陽性率為97.2﹪(11520/11844).同一組織不同LDA GAPDH檢測Ct值之差最大為0.952,最小0.001,平均Ct值之差在0.279±0.254.Spearman相關分析和Logistic回歸分析發(fā)現兩次實驗檢測結果高度相關(p<0.0001,r=0.911,r<'2>=0.829).94個基因

8、在不同實驗之間的ACt值差異,94個基因兩次實驗間的ACt值差平均為0.3±0.33.Spearman相關分析和Logistic回歸分析發(fā)現各基因兩次實驗間ACt差平均值與基因平均ACt值呈高度線性正相關(p4.0001,r=0.743,r<'2>=0.551).配對正常和腺癌組織之間LDA鑒定了79個差異表達基因(p<0.05),癌組織表達上調4個,下調75個,2倍以上34個.其中,Wnt信號通路基因NKD1和SOX9在結直腸癌組織表

9、達顯著上調,分別較正常上調15.15倍和1.62倍,APC、DAAM2、TCf4等基因表達顯著下調,分別較正常下調2.71倍、3.81倍和2.18倍.與正常組織相比,TGFβ/BMP4信號通路基因TGFBl、SMAD4、L3MBTL,等在結直腸癌組織分別下調2.41倍、2.51倍和1.39倍,HH信號通路基因IHH、DISP1、DISP2等在結直腸癌組織分別下調2.03倍、1.79倍和13.96倍,Notch信號通路基因NOTCH2、M

10、AML1、MAL2、MAML3、HES1、HES2等基因在結直腸癌分別下調2.22倍、1.91倍、2.39倍、1.96倍、1.76倍、1.76倍,PeG基因家族EZH2在結直腸癌組織上調1.64倍,EPC1、EPC2、PCGF1、PCGF2、PCGF3、PCGF4、PCGF5、PCGF6等分別下調2.28倍、1.96倍、1.93倍、2.02倍、1.63倍、1.49倍、2.28倍和1.58倍.7例正常、腺瘤及腺癌配對組織LDA檢測發(fā)現59

11、個差異表達基因(p4.05).在結直腸腺瘤,上述各基因的表達趨勢基本上與腺癌一致. SYBR Q-PCR檢測了19個基因在22例正常、腺癌配對結直腸組織的表達,發(fā)現SOX9、EPC1、EPC2、CECR1、KLF9、METRNLNKDl、NJMB、SPRED2、DISP2等10個基因在結直腸癌組織的表達改變有統(tǒng)計學顯著意義(p<4.05).全部19個基因SYBR Q-PCR.與LDA的表達趨勢(2<'△△ct>)一致.19個基

12、因的中位表達變化倍數相關分析發(fā)現,兩種方法檢測結果高度相關 (p=0.003,r=0.79,r<'2>=0.637).最后,我們對結直腸癌表達上調基因SOX9進行了比較全面的臨床病理研究.20例結直腸癌及6個細胞系DNA測序未能發(fā)現SOX9基因編碼區(qū)存在突變.21例結直腸正常、腺癌及5個伴發(fā)腺瘤配對組織 Western-blot 檢測發(fā)現,SOX9、β-Catenin 分別在16例和15例腺癌表達上調,各有5個和2個腺瘤表達上調.結直腸

13、癌SOX9、β-catenin蛋白表達上調有顯著統(tǒng)計學意義 (Mean±SD:SOX9正常0.3293±0.3863,腺癌0.907±0.6413,p<0.01;β-catenin正常0.3397±0.2921,腺癌0.6024±0.498,p<0.05).免疫組織化學染色發(fā)現,正常粘膜SOX9+細胞主要位于隱窩基底部,正常粘膜下部陽性細胞數 (9.6±13.1﹪)顯著高于上部(3.1±5.9﹪)(p<0.001),與Ki67染色的分布

14、特征吻合.在結直腸腺瘤,SOX9+細胞沿隱窩彌漫分布,但腺瘤底部陽性細胞數要高于上部 (50.7﹪±25.1﹪ vs 32.9﹪±30.0﹪,p<0.001).結直腸腺瘤 SOX9+ 細胞(39.8﹪±30.9﹪) 要顯著高于瘤旁殘留黏膜 (24.9﹪±18.2﹪),結直腸癌SOX9總體表達率為 36.7﹪±30.3﹪,顯著高于正常粘膜和瘤旁殘留粘膜 (p<0.001),但與腺瘤表達差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05).結直腸腺瘤SOX9陽

15、性率為74.5﹪(70/94),結直腸癌陽性率為60.1﹪(113/188),腺瘤與癌的陽性率顯著高于正常粘膜 (10/110,9.09﹪)(p<0.001).如把"-"和"-"定義為SOX9低表達,"++"和"++"合并為高表達,我們發(fā)現SOX9高表達分別見于50例(53.2﹪)結直腸腺瘤和64例(34.0﹪)結直腸癌,正常粘膜未見有SOX9高表達.結直腸腺瘤和癌組織SOX9高表達率顯著高于正常粘膜(p<0.001).SOX9高表達在

16、黏液腺癌/印戒細胞癌相對非黏液/印戒細胞癌少見(p<0.05,x<'2>檢驗).SOX9高表達的結直腸癌五年生存率為39.5﹪(17/43),顯著低于SOX9低表達的結直腸癌69.5﹪(66/95)(p<0.01).多因素COX分析發(fā)現,SOX9高表達是結直腸癌預后不良的獨立指標(p<0.05,RR=1.381,95﹪CI:1.051-1.815). 通過上述研究,本文得出以下結論: ①結直腸癌在分子水平呈高度異質性,變

17、異性剪接在結直腸癌發(fā)生過程中有重要作用,核糖體蛋白基因富集是結直腸腺瘤與炎癥性腸病等癌前病變的重要分子特征.因此,結直腸電子文庫的構建有助于揭示結直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的總體分子特征,對于加深我們對結直腸癌發(fā)生機制的理解有重要意義. ②結直腸上皮細胞分化關系密切的Wnt信號通路激活及TGFβ/BMP、HH、Notch等信號通路抑制及PcG家族表達改變在結直腸癌的發(fā)生過程中有重要作用,且這些信號通路之間存在復雜的相互作用網絡.