人類尿苷胞苷激酶基因的功能研究.pdf

1、在該論文的第一章中主要是對(duì)人類尿苷胞苷激酶(UCK,EC 2.7.1.48)基因進(jìn)行的一系列研究.UCK是能將尿苷和胞苷磷酸化成一磷酸尿苷和一磷酸胞苷的嘧啶核苷激酶,該實(shí)驗(yàn)室克隆到的UCK基因表達(dá)后經(jīng)活性檢測(cè)具有磷酸化胞苷的作用,并發(fā)現(xiàn)該基因定位在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮它的生理作用.UCK在16種人的組織中的mRNA表達(dá)譜表明,這個(gè)基因廣泛頒在多個(gè)組織中,其中肝臟、睪丸、心臟中表達(dá)較為豐富.Northern Blot方法檢測(cè)了UCK在6對(duì)肝癌和癌

2、旁組織中的表達(dá)情況,并且半定量RT-PCR方法檢測(cè)另外30對(duì)肝癌及癌旁組織UCK的表達(dá)豐度.結(jié)果顯示,UCK在肝癌組織中比癌旁組織中的表達(dá)量明顯升高.原核表達(dá)并純化UCK蛋白,并以重組蛋白為抗原制備了兔源的多克隆抗體,用它進(jìn)行肝癌及癌旁組織的表達(dá)情況及免疫組化的研究,結(jié)果顯示,蛋白水平上,UCK在肝癌組織中呈顯著上調(diào)表達(dá)趨勢(shì).通過在不同發(fā)育階段的大鼠中檢測(cè)UCK的表達(dá)豐度,顯示UCK在大鼠胚胎期的表達(dá)量很高,隨著出生以后細(xì)胞增殖速度的減

3、慢,表達(dá)量逐漸下降.UCK有望成為顯示肝癌細(xì)胞增殖速度的一個(gè)分子標(biāo)記.由于UCK在磷酸化它的生理性底物尿苷和孢苷的同時(shí),也能將一些細(xì)胞毒性的核苷類似物磷酸化,因而在腫瘤的化療中發(fā)揮著其獨(dú)特的作用.這些核苷類似物包括6-氮尿苷、5-氟尿苷等,一旦這些化合物被磷酸化,它們就干擾一些重要的細(xì)胞生理過程.將表達(dá)UCK不同豐度的肝癌細(xì)胞進(jìn)行6-氮尿苷的敏感試驗(yàn)顯示,6-氮尿苷對(duì)UKC表達(dá)量較高的HepG2細(xì)胞的毒性作用強(qiáng)于對(duì)UCK表達(dá)量較低的L0

4、2細(xì)胞,提示UCK有可能成為臨床用藥的一個(gè)參考指標(biāo),克隆人類尿苷胞苷激酸對(duì)尋找新的嘧啶核苷類似物并研究它們的藥理活性有著重要的意義.第二章的內(nèi)容是對(duì)該實(shí)驗(yàn)室克隆的人類肝臟和睪丸中特異表達(dá)的基因TCP10L的功能研究.首先通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法,發(fā)現(xiàn)該基因中含有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu).由于很多已知的轉(zhuǎn)錄因子都含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),推測(cè)這個(gè)基因可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的效應(yīng).將TCP10L重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293,SK-HEP-1和CHO細(xì)胞,采用雙熒光

5、報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性,報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)在上述三種細(xì)胞中較對(duì)照組分別下降了2.6,9.8和5.5倍,當(dāng)用定點(diǎn)突變的方法破壞TCP10L的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)從而影響了蛋白的空間構(gòu)象時(shí),這種轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)很快喪失.實(shí)驗(yàn)證明,TCP10L具有轉(zhuǎn)錄抑制活性.我們又將TCP10L與EGFP融合,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞核內(nèi).因此,TCP10L基因可能通過識(shí)別和結(jié)合DNA上的特異序列而發(fā)揮它的轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng),這種應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)有賴于它具