牙鲆抗淋巴囊腫病相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及兩種免疫相關(guān)基因的克隆與初步分析.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，被廣泛養(yǎng)殖。近年來，隨著牙鲆養(yǎng)殖規(guī)模不斷壯大，各種病害頻繁發(fā)生。為了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，應(yīng)采取傳統(tǒng)育種與分子手段相結(jié)合的手段培育性能更好的新品種。本文以牙鲆為材料，篩選出了與牙鲆抗淋巴囊腫病相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記，并對(duì)兩種免疫相關(guān)基因進(jìn)行了克隆及初步分析。得到了一以下結(jié)果:
　?、?、牙鲆抗淋巴囊腫病相關(guān)微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選
　　為了篩

2、選出中國(guó)牙鲆群體的抗淋巴囊腫病相關(guān) SSR標(biāo)記，采用分群分析法對(duì)102個(gè)牙鲆個(gè)體（感病56個(gè)，抗病46個(gè)）進(jìn)行了抗淋巴囊腫病相關(guān)SSR標(biāo)記的篩選。首先構(gòu)建了抗、感基因池（抗病個(gè)體和感病個(gè)體各15個(gè)），并利用178對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)其進(jìn)行了掃描；對(duì)于在抗、感池間擴(kuò)增出差異條帶的引物，用構(gòu)成抗、感池的30個(gè)個(gè)體對(duì)其進(jìn)行了第一次單個(gè)體驗(yàn)證；對(duì)于在第一次單個(gè)體驗(yàn)證中差異顯著的引物用102個(gè)個(gè)體進(jìn)行了第二次驗(yàn)證。結(jié)果顯示，有4對(duì)引物（scaffold

3、440_22585、scaffold826_5003、scaffold703_4284和scaffold185_597）在抗、感基因池間擴(kuò)增出了差異條帶；經(jīng)第一次單個(gè)體驗(yàn)證，表明scaffold826_5003（P=0.023）和scaffold185_597（P178bp=0.028，P173bp=0.009）的差異條帶在抗、感個(gè)體中呈顯著性差異；經(jīng)第二次單個(gè)體驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)scaffold185_597的差異條帶在抗、感個(gè)體中出現(xiàn)的頻率

4、分別為60.9％和14.3%（P=0.001），差異顯著；對(duì)scaffold185_597在10個(gè)抗病個(gè)體中擴(kuò)出的差異條帶進(jìn)行了克隆并測(cè)序，經(jīng) blast比對(duì)，證實(shí)其為黃海所水產(chǎn)基因組與細(xì)胞工程研究室公布的牙鲆微衛(wèi)星標(biāo)記scaffold185_597中的一段，同源性達(dá)到96%。研究表明微衛(wèi)星標(biāo)記 scaffold185_597可能與牙鲆抗淋巴囊腫病相關(guān)，為中國(guó)牙鲆分子標(biāo)記輔助育種提供了參考。
　?、?、牙鲆免疫相關(guān)基因的克隆與初步分

5、析
　　選用補(bǔ)體相關(guān)基因C1q-like3和胞粘蛋白因子基因Cytohesin-1，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)兩個(gè)基因分別進(jìn)行了克隆，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。之后，對(duì)牙鲆C1q-like3基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)分析；并在牙鲆Cytohesin-1基因中篩查了單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。從而對(duì)兩種免疫相關(guān)基因的功能與牙鲆抗病的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析。
　　1.C1ql3基因的克隆與表達(dá)分析
　　補(bǔ)體系統(tǒng)是一種重要的免

6、疫效應(yīng)系統(tǒng)，在先天性免疫中起著非常重要的作用。補(bǔ)體相關(guān)分子廣泛存在，并參與宿主的免疫應(yīng)答。研究克隆了牙鲆C1q-like3基因（定義為PoC1ql3）。PoC1ql3的cDNA全長(zhǎng)1482bp，包括4bp的5’UTR，801bp的編碼區(qū)和677bp的3’UTR。801bp的開放閱讀框編碼266個(gè)氨基酸，與其基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。同源比對(duì)和進(jìn)化分析表明，牙鲆C1ql3基因與斑馬魚和羅非魚親緣關(guān)系很近。健康組織

7、C1ql3的實(shí)時(shí)定量分析顯示PoC1ql3在肝臟和脾臟中高表達(dá)，在血液和肌肉中很少表達(dá)，并在其他組織中低表達(dá)。鰻弧菌感染后，C1ql3在肝中的表達(dá)在6h達(dá)到最高峰，在脾中則在48h上升到最大值，分別是其PBS對(duì)照組的2.89和2.64倍。細(xì)菌的感染能顯著增加PoC1ql3在免疫組織中的表達(dá)，這可能說明了C1ql3與牙鲆炎癥反應(yīng)和自我平衡功能相關(guān)。
　　2.Cytohesin-1基因的克隆與SNP檢測(cè)
　　Cytohesin-

8、1基因在小鼠、人類等物種的研究表明，其在機(jī)體中發(fā)揮免疫功能的作用，與免疫調(diào)節(jié)具有一定的相關(guān)性。研究通過基因克隆技術(shù)獲得了牙鲆Cytohesin-1基因的cDNA全長(zhǎng)序列1631bp，包括175bp的5’UTR，1203bp的開放閱讀框和253bp的3’UTR。1203bp的開放閱讀框共編碼400個(gè)氨基酸。cDNA序列與基因組序列比對(duì)結(jié)果顯示，牙鲆 Cytohesin-1基因含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。多氨基酸序列比對(duì)表明，該基因在各