番茄灰霉病生物防治高效拮抗菌株的篩選及遺傳改造.pdf

1、為了解決番茄灰霉病問題，采集淄博市感染灰霉病的大棚蔬菜土壤樣品，采用稀釋分離法分離到6株拮抗細(xì)菌菌株B-01、B-02、B-03、B-04、B-06、B-07.拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明6個菌株均具有很強(qiáng)的抗灰霉病菌活性.根據(jù)抑菌圈大小，B-02、B-04、B-06抗性比較強(qiáng)，抑菌圈半徑>14.0mm，其中拮抗作用最強(qiáng)的B-06菌株，抑菌圈半徑達(dá)20.1mm.對其進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化特性測定以及16S rDNA序列分析，結(jié)果顯示6株細(xì)菌均為

2、直的桿狀，有鞭毛能運(yùn)動，能生成抗熱的芽孢，芽孢橢圓形，革蘭氏染色均為陽性.對16S rDN序列進(jìn)行測定和同源性比對，依據(jù)《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology》第九版芽孢桿菌屬內(nèi)特征，結(jié)合生理生化反應(yīng)特性確定B-01，B-02，B-03，B-04為蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)，B-06為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，B-07為短小芽孢桿菌 (

3、Bacillus pumilus). 為了進(jìn)一步確定其抑菌作用，對濾液抑菌活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)B-02、B-06濾液對灰霉病原菌均有很強(qiáng)的抑制作用，培養(yǎng)皿上在滴有對照液的一側(cè)，菌絲向前伸展，菌絲形態(tài)表現(xiàn)正常.而滴有濾液的一側(cè)，菌絲生長速度遠(yuǎn)低于對照側(cè)，菌絲形態(tài)發(fā)生畸變，不能正常向四周生長，菌落邊緣不整齊，變異部分菌落顏色變深.濾液在稀釋不同倍數(shù)時均能抑制灰霉病菌的萌發(fā)，使其不能進(jìn)一步發(fā)育成菌絲體，失去侵染能力，但隨著稀釋倍數(shù)的增加

4、，抑菌率顯著降低.其余四株無明顯的抑菌作用. β-1，3-葡聚糖酶能降解植物病原真菌細(xì)胞壁β-1，3-葡聚糖多聚體，從而抑制真菌的生長及增殖.因此本實(shí)驗(yàn)將β-1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化到拮抗菌中，以增強(qiáng)其防病效果.用兩種限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切質(zhì)粒pUC1940，酶切可得到兩種DNA片斷，其一為4.1kb，其二為2.7kb，經(jīng)0.8﹪瓊脂糖凝膠電泳，回收4.1kb的片斷(含有啟動子的β-1，3-葡聚糖酶基因)；同樣用

5、限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pBE2和pHY300PLK，將4.1kb的片斷與質(zhì)粒pBE2和pHY300PLK連接，獲得重組質(zhì)粒pBE2-glu和pHY300PLK-glu，電擊轉(zhuǎn)化6株芽孢桿菌，只有B-04轉(zhuǎn)化成功，在1400V、50uF、200Ω、2mm獲得最大轉(zhuǎn)化個數(shù).將工程菌株命名為 B-04-glu，與野生菌株相比，B-04-glu在ABP平板上可以看到透明的水解圈，表明轉(zhuǎn)入β-1，3-