麻黃—白術(shù)藥對主要化學成分、藥效及尿液代謝物研究.pdf

1、研究背景與意義：
　　 藥對，又稱對藥，由兩味藥成對，個別由三味以上藥組成，是臨床上常用的相對固定的配伍形式。藥對組成形式主要是在七情配伍的基礎(chǔ)上，以一定證候特點及采用相應治法為前提，根據(jù)藥物的性味歸經(jīng)、升降浮沉，選擇性地將兩味或兩味以上的中藥進行配對，其配伍蘊涵著豐富的客觀規(guī)律。藥對的配伍規(guī)律是基于中醫(yī)藥理論體系，能體現(xiàn)疾病證型、病機及藥物特點而配合應用的藥物間的聯(lián)系，它是歷代醫(yī)家的經(jīng)驗總結(jié)，并經(jīng)歷了從感性認識到理性認識的飛躍

2、，具有普遍性、重復性的特點。
　　 我們進行藥對組成規(guī)律研究的意義:(1)進一步揭示藥對配伍的客觀規(guī)律與科學內(nèi)涵，闡明藥對配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機理，在更廣的范圍、更深的層次展現(xiàn)中醫(yī)治療疾病的科學原理。(2)指導臨床遣方用藥，既能更有效地運用已有的藥對，亦利于針對疾病譜的變化、病證的發(fā)展而創(chuàng)制新藥對。(3)隨著藥對的作用機理與物質(zhì)基礎(chǔ)更加明確，在新藥研究中以有效成分或有效部位配伍已越來越多，中西藥配伍亦不鮮見，傳統(tǒng)配伍的普遍規(guī)律同

3、樣可以指導新的配伍形式，對中藥新產(chǎn)品制劑處方研創(chuàng)具有現(xiàn)實意義。
　　 本藥對組成規(guī)律研究遵循中醫(yī)藥的“理法方藥”診療理論，選擇麻黃加術(shù)湯及麻黃-白術(shù)藥對為研究對象，按性味的“七情合和”配伍，以藥味配比量為切入點，將藥對配伍研究分解為:(1)藥對配伍前后的體外化學成分變化研究。(2)主要藥理效應（毒性）比較研究。(3)藥對配伍對代謝組生物信息干預的研究。(4)運用解析多變量復雜關(guān)系的數(shù)理統(tǒng)計方法進行分析。通過麻黃-白術(shù)藥對配伍、化

4、學成分變化、藥理效應改變、體內(nèi)代謝途徑與機制幾者間的內(nèi)在聯(lián)系，揭示藥對的組成規(guī)律，據(jù)此為中醫(yī)臨床遣方用藥、創(chuàng)制新藥對及開發(fā)新藥提供理論和實驗依據(jù)。
　　 目的：
　　 通過比較麻黃與白術(shù)不同配伍配比對水煎液中有效成分含量的影響，探求麻黃與白術(shù)藥對的化學變化規(guī)律。以期從物質(zhì)基礎(chǔ)的變化來闡述藥理效應變化的內(nèi)因。
　　 通過比較麻黃與白術(shù)不同配伍配比對急性毒性、發(fā)汗作用、鎮(zhèn)痛作用、利尿作用的影響，定量評價麻黃和白術(shù)配伍

5、后主要藥理效應的變化，以判斷藥物是否增效減毒。
　　 通過運用代謝組學技術(shù)探討大鼠灌胃麻黃、白術(shù)和麻黃-白術(shù)藥對配伍后對尿液中生物標志物的影響，尋找表征這一變化過程的生物標志物，從系統(tǒng)與整體層面探討麻黃配伍白術(shù)的相互作用機制。
　　 方法：
　　 1.麻黃-白術(shù)藥對不同配伍配比的體外化學成分研究分析在制備過程（體外）中化學成分數(shù)和量的變化，探討麻黃、白術(shù)主要效應成分在制備過程中的理化變化和相互影響。
　　

6、 采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)考察麻黃水煎液及麻黃-白術(shù)藥對不同配比共煎液中麻黃類生物堿（麻黃堿、偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿和甲基麻黃堿）含量的變化情況;采用高效液相色譜法(HPLC）考察白術(shù)水煎液及麻黃-白術(shù)藥對不同配比共煎液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的指紋圖譜峰的變化情況。比較麻黃與白術(shù)不同比例配伍前后水煎液中有效成分含量的變化。2.麻黃-白術(shù)藥對不同配比的主要藥理效應（主證）比較研究以毒副作用、發(fā)汗作用、鎮(zhèn)痛作

7、用、利尿作用、藥物相互作用等相關(guān)指標，從藥理效應相互關(guān)系方面分析藥對配伍（偶合）對靶標效應強度的規(guī)律。
　　 急性毒性實驗及相互作用研究采用昆明小鼠，按照麻黃、白術(shù)、麻黃白術(shù)(3∶2)、麻黃白術(shù)(3∶4)、麻黃白術(shù)(3∶8)分為5個給藥組，采用小鼠半數(shù)致死量(LD50)測定來評價麻黃、白術(shù)及麻黃-白術(shù)藥對三個配比的急性毒性，無法測得LD50值的，采用測定其最大耐受量(MTD)的方法以獲取其安全性信息。
　　 發(fā)汗藥效實驗

8、研究采用SD大鼠，通過比較大鼠腋窩部和足趾部皮膚汗腺，確定了取材部位，建立了定量評價發(fā)汗強度的方法。采用汗腺導管面積為指標考察了麻黃-白術(shù)藥對配伍對大鼠的發(fā)汗作用。
　　 鎮(zhèn)痛藥效實驗研究采用昆明小鼠，運用熱板鎮(zhèn)痛和光輻射熱甩尾鎮(zhèn)痛法，考察麻黃、白術(shù)、麻黃-白術(shù)藥對及麻黃加術(shù)湯全方的鎮(zhèn)痛作用;依據(jù)中效原理(Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法)，應用Calcusyn統(tǒng)計軟件(Biosoft，USA)分析，繪制單味藥及二藥配伍使用對

9、小鼠痛閾的影響曲線，確定二藥的效應(fa)-合用指數(shù)(CI)的關(guān)系，根據(jù)曲線定量評價麻黃與白術(shù)鎮(zhèn)痛的相互作用
　　 利尿藥效實驗研究采用SD大鼠，運用水負荷排尿?qū)嶒?代謝籠法，考察麻黃、白術(shù)、麻黃-白術(shù)藥對大鼠的利尿作用;采用昆明小鼠，運用濾紙稱重法，考察麻黃、白術(shù)、麻黃-白術(shù)藥對小鼠的利尿作用，探索藥對配伍對于利尿作用的影響。
　　 3.麻黃-白術(shù)藥對配伍的代謝組學研究選用SD大鼠40只，雄性，隨機分為4組，即空白對照

10、組、麻黃組、白術(shù)組和麻黃白術(shù)3∶4組，每組10只。生理鹽水、麻黃水煎液、白術(shù)水煎液、麻黃-白術(shù)藥對水煎液給大鼠灌胃，每天收集8h尿液，尿液離心后衍生化。采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)測定各組大鼠尿液代謝物譜。將所得的GC-MS數(shù)據(jù)進行峰識別、峰對齊、扣除溶劑峰、雜質(zhì)峰的處理。導出的數(shù)據(jù)進行峰面積歸一化處理，生成二維矩陣。將矩陣導入模式識別軟件Simca-P12.0進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，分析麻黃組、白術(shù)組

11、、麻黃-白術(shù)藥對組生物標志物的差異及水平變化。
　　 4.統(tǒng)計學處理
　　 運用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-wayANOVA)，方差齊性采用LSD法;方差不齊，Welch法校正后采用Games-Howell法多重比較。所有檢驗水平α=0.05(雙側(cè))。
　　 結(jié)果：
　　 1.麻黃-白術(shù)藥對不

12、同配伍配比的體外化學成分研究
　　 與麻黃單煎液相比，麻黃白術(shù)配伍后，隨著白術(shù)的配伍比例增大，水煎液中去甲基偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿含量均有所下降。
　　 與白術(shù)單煎液相比，麻黃白術(shù)配伍后，水煎液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ均有不同程度的降低。
　　 2.麻黃-白術(shù)藥對不同配伍配比主要藥理效應（主證）比較研究
　　 急性毒性實驗麻黃LD50值為79.098 g·kg-1

13、，白術(shù)和三個藥對配伍組均無法測得LD50值，均測得其最大耐受量(MTD)，白術(shù)三個配伍組及全方配伍均對麻黃的毒性具有拮抗作用。
　　 發(fā)汗藥效實驗模型動物的選擇，以大鼠為優(yōu)，取材部位選取足趾部皮膚汗腺，取材時間為給藥后1h。麻黃有較好的發(fā)汗作用，白術(shù)不明顯，麻黃白術(shù)配伍后，對于麻黃的發(fā)汗效力有拮抗作用，其中以麻黃白術(shù)(3∶4)組影響最為顯著。
　　 鎮(zhèn)痛藥效實驗與空白組相比，各給藥組均不同程度的具有提高小鼠痛閾值，抑制小

14、鼠甩尾的作用，說明單味麻黃、單味白術(shù)及麻黃白術(shù)配伍后均具有鎮(zhèn)痛作用，在相同劑量時，效應強弱順序為麻黃白術(shù)(3∶4)組＞白術(shù)組＞麻黃組;與單味藥相比，麻黃白術(shù)配伍后鎮(zhèn)痛作用有所增強，說明麻黃、白術(shù)配伍后，鎮(zhèn)痛作用為協(xié)同作用。
　　 利尿藥效實驗大鼠的代謝籠法及小鼠的濾紙稱重法實驗結(jié)果均表明，麻黃-白術(shù)藥對配伍能增加正常大鼠及正常小鼠排尿量，與單味藥材相比，藥對配伍使其利尿效應增強。
　　 3.代謝組學研究
　　 與

15、空白對照組比較，白術(shù)組存在差異的生物標志物有:正丙胺、α-酮戊二酸、己二酸、檸檬酸、馬尿酸、色氨酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸;麻黃組與空白對照組存在差異的生物標志物有:正丙胺、馬尿酸、丙氨酸、色氨酸;麻黃白術(shù)(3∶4)組與空白對照組存在差異的生物標志物有:正丙胺、α-酮戊二酸、己二酸、檸檬酸、馬尿酸、半胱氨酸、烏頭酸、丙氨酸、氨基馬尿酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸、色氨酸。與空白對照組比較，生物標志物水平顯著下調(diào)的有:正丙胺、α-酮戊二酸、己二酸、檸

16、檬酸、馬尿酸;生物標志水平顯著上調(diào)的有:半胱氨酸、烏頭酸、丙氨酸、氨基馬尿酸、甲基黃嘌呤、酪氨酸、色氨酸。
　　 結(jié)論：
　　 1化學成分分析實驗結(jié)果表明，麻黃與白術(shù)配伍后，麻黃中各有效成分的溶出率明顯減少，其溶出率與白術(shù)在藥對中所占的比例有關(guān)，比例越大，麻黃堿類成分溶出率越小;藥對配伍后，白術(shù)中各有效成分的溶出率與白術(shù)單煎液相比也明顯減少，麻黃白術(shù)配伍后對彼此有效成分的溶出有一定的抑制作用。
　　 2藥對配伍使

17、用多起到增效減毒的作用。結(jié)合急性毒性實驗、發(fā)汗實驗、鎮(zhèn)痛實驗、利尿?qū)嶒灥妊芯拷Y(jié)果，對麻黃-白術(shù)藥對不同配伍配比進行分析。麻黃白術(shù)配伍使用后，對麻黃的毒性有拮抗作用，發(fā)汗作用有拮抗作用，鎮(zhèn)痛作用有協(xié)同作用，利尿作用有協(xié)同作用。其中麻黃白術(shù)(3∶4)配伍的減毒增效作用十分明顯。這與經(jīng)方麻黃加術(shù)湯中麻黃和白術(shù)的配伍比例相吻合。
　　 3藥對配伍對大鼠尿液代謝標志物的影響
　　 麻黃、白術(shù)單味藥影響的代謝標志物不同，麻黃-白術(shù)藥