重組人雌激素受體基因酵母細胞對家畜尿液中雌激素類藥物殘留的檢測研究.pdf

1、動物性食品中雌激素類藥物殘留對人類健康造成損害，同時還影響到環(huán)境和畜牧業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展，并引起了廣泛的關(guān)注。目前，檢測雌激素類藥物殘留的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)等。這些方法有其優(yōu)點，也有其局限性，都存在對檢測操作人員、精密檢測儀器要求高，對待測樣品有一定的純度要求，受檢測場地等因素限制等缺點，不適用于常規(guī)動物食品安全監(jiān)督。因此，建立簡便、快速、有效的動物體內(nèi)雌激素類藥物殘

2、留檢測方法顯得尤其重要。
　　目的：本文構(gòu)建了重組人雌激素受體(hER)基因酵母細胞(W303-1A/hER-ERE-LacZ，W303-1A/hER-ERE-yEGFP)，W303-1A/hER-ERE-Lac Z是一種酵母細胞傳感器，其LacZ報告基因受hER的調(diào)控，當(dāng)雌激素類藥物與hER結(jié)合時，會使LacZ基因的表達產(chǎn)物β-半乳糖苷酶大量升高，通過測其活性，可以監(jiān)測尿液中雌激素類藥物的含量，特別適合基層單位開展日常的監(jiān)測工作

3、;而W303-1A/hER-ERE-yEGFP是一種發(fā)光酵母細胞，通過測其發(fā)光度，檢測尿液中雌激素類藥物的含量，不需添加任何試劑，具有快速簡便的特點。構(gòu)建方法和應(yīng)用如下:
　　材料與方法:(1)將受雌激素效應(yīng)元件調(diào)控的pMP206/ERE和pLZ-yEGFP載體用醋酸鋰(LiAC)方法，分別轉(zhuǎn)化于可表達雌激素受體(hER)的酵母細胞，經(jīng)SD/-trp，-ura選擇性培養(yǎng)板，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，并對其進行PCR鑒定，從而構(gòu)建成受雌激素

4、調(diào)控的Lac Z基因酵母細胞和yEGFP發(fā)光酵母細胞，分別命名為W303-1A/hER-ERE-Lac Z和W303-1 A/hER-ERE-yEGFP，并將其劃線接種于SD/-trp，-ura選擇平板上，于30℃培養(yǎng)出克隆;(2)從重組基因酵母培養(yǎng)板挑取單個酵母克隆，于酵母培養(yǎng)液30℃振蕩培養(yǎng)活化，并用酵母細胞培養(yǎng)液稀釋3倍;(3)從規(guī)?；B(yǎng)殖場采集犢牛、懷孕母牛尿樣計22份，采集不同階段仔豬和母豬尿樣計78份，分別經(jīng)過濾、水解、C1

5、8柱吸附、用三氯甲烷洗脫、經(jīng)二甲基亞砜處理定容處理;(4)取0.010 mL甲基亞砜定容液分別作用于W303-1A/hER-ERE-Lac Z和W303-1A/hER-ERE-yEGFP細胞，30℃振蕩作用6h，分別測β-半乳糖苷酶的活性或細胞的發(fā)光強度。用雌二醇（己烯雌酚、炔雌醇）作為陽性對照，蒸溜水作為試劑空白對照。
　　結(jié)果:兩種重組基因酵母細胞對所有的加標(biāo)（雌二醇、己烯雌酚、炔雌醇）均呈陽性結(jié)果。用W303-1A/hER-

6、ERE-Lac Z測定，雌二醇的檢出限為10-12mol/L，懷孕母牛、犢牛、仔豬和不同時期母豬的尿樣中的雌激素類化合物與空白對照比較無顯著性差異(P＞0.05);仔豬與不同時期母豬尿樣中雌激素化合物未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);用W303-1 A/hER-ERE-yEGFP研究發(fā)現(xiàn)，雖然懷孕母牛尿樣中的雌激素化合物高于犢牛，但經(jīng)統(tǒng)計分析無顯著性差異(P＞0.05)，而仔豬與不同時期母豬尿樣中的雌激素化合物濃度很低，低于W303-1

7、A/hER-ERE-yEGFP細胞的檢出限水平（＜10-9 mol/L雌二醇當(dāng)量）。
　　結(jié)論:(1)該方法可檢測已知和未知的具有雌激素樣作用的化合物或藥物，具有簡便、快速、靈敏等特點，適合大量樣本的基層初級篩選;(2)該方法樣品對象為尿液，相對于其他樣品，采集比較方便，并能實現(xiàn)活體檢測，可在降低畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測成本的同時，對畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管實行及時有效預(yù)警;(3)本文所采集的樣品均來自規(guī)?；B(yǎng)殖企業(yè)，飼養(yǎng)比較規(guī)范，未在飼料中