C6神經(jīng)酰胺增敏長春新堿抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　傳統(tǒng)腫瘤化療藥（如長春新堿）使用存在嚴(yán)重局限，腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)腫瘤化療藥存在先天或獲得性耐藥，這是由于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平或活性的改變，以及影響藥物的活性和/或代謝的蛋白的影響?；熢雒舻鞍滓恢笔前┌Y研究的一大焦點(diǎn)。許多研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的短鏈細(xì)胞滲透性神經(jīng)酰胺(C6)的活性，以增加現(xiàn)有的化療藥物的抗腫瘤活性。C6神經(jīng)酰胺顯著提高的多個(gè)抗癌藥物的活性，包括紫杉醇、阿霉素和組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)。但這個(gè)增敏

2、的分子機(jī)制仍然是不明確。
　　長春新堿是一種常用的抗癌化療藥物。它是一種細(xì)胞周期特異性的藥物，結(jié)合于微管蛋白，抑制微管結(jié)構(gòu)的組裝和阻止有絲分裂的中期，使癌細(xì)胞不能發(fā)生有絲分裂。它已被廣泛地應(yīng)用于各種類型的化療方案用于治療患者腫瘤，在不同的癌癥中其有效率變化大，使用后癌細(xì)胞會表現(xiàn)出耐藥的趨勢發(fā)展。長春新堿誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的分子機(jī)制仍然不清楚。我們以前的研究已經(jīng)表明，激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMPK)可能是介導(dǎo)長春新堿活性的關(guān)鍵信號。我

3、們團(tuán)隊(duì)一直注重AMPK對癌細(xì)胞的抑制能力。持續(xù)激活A(yù)MPK示通過調(diào)節(jié)多個(gè)下游信號的目標(biāo)來誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡和生長抑制，包括在活化的mTOR復(fù)合體1(mTORC1)、磷酸化的p53、激活自噬，等等。
　　這里我們顯示，在多個(gè)人類癌細(xì)胞系中，無論是在體內(nèi)和體外， C6神經(jīng)酰胺顯著地提高了長春新堿誘導(dǎo)的抗癌活性。在分子水平上，我們發(fā)現(xiàn)AMPK依賴性p53活化可能是介導(dǎo)的敏化效應(yīng)關(guān)鍵的信號。
　　研究方法和材料：
　　人結(jié)腸癌HC

4、T-116細(xì)胞，人胰腺癌PANC-1細(xì)胞和人卵巢癌A2780細(xì)胞中，所有細(xì)胞均從上海生命科學(xué)研究院（上海，中國）購買，并維持在RPMI/DMEM培養(yǎng)基中（Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州），加入10％的FBS（Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州），青霉素/鏈霉素(1∶100，Sigma)，培養(yǎng)在37℃CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞給予指定的C6神經(jīng)酰胺和或長春新堿處理，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，運(yùn)用MTT方法檢測細(xì)胞存活率，同時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)染色

5、，計(jì)算活細(xì)胞率;運(yùn)用組蛋白DNA-ELISA及AnnexinⅤ試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，LDH分析法檢測細(xì)胞死亡率，線粒體免疫共沉淀分離線粒體，通過JC-10染料測定細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)，Western blot檢測總的和磷酸化的AMPKα、ACC、P53、CYP-D、Bcl-2、HIF-1α、S6K1等信號通路的改變;運(yùn)用程序性死亡抑制劑及凋亡抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證C6神經(jīng)酰胺和長春新堿誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方式。建立CYP-D-shRNA、p53-

6、shRNA、AMPKα1-shRNA及AMPK-α1顯性失活(DN)突變（DN-AMPK-α1）cDNA穩(wěn)轉(zhuǎn)的腫瘤細(xì)胞，運(yùn)用上述方法進(jìn)一步驗(yàn)證信號通路的改變。制備脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺，運(yùn)用上述方法驗(yàn)證其體外活性，建立裸鼠模型，予以分組靜脈給藥，記錄裸鼠存活率，腫瘤大小，免疫組化檢測組織AMPKα表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺增強(qiáng)長春新堿的抗腫瘤機(jī)制。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，至少使用三個(gè)孔/平皿。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少

7、三次，每次獲得具有相似的結(jié)果。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。使用SPSS15.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，通過one-way ANOVA，Scheffe和Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試劑的濃度和治療持續(xù)時(shí)間基于發(fā)表文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　研究結(jié)果：
　　1、C6神經(jīng)酰胺在多個(gè)人腫瘤細(xì)胞系顯著提高了長春新堿誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性。長春新堿單獨(dú)只有適度抑制HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞存活，與C6神經(jīng)酰胺共同用藥顯著增加長春

8、新堿的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力大幅降低。C6神經(jīng)酰胺的效果是劑量依賴性的，2.5-10.0μg/mL的C6能夠顯著增加長春新堿的活性，而C6神經(jīng)酰胺本身對HCT-116細(xì)胞的存活率幾乎沒有影響。C6神經(jīng)酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥導(dǎo)致了大量的細(xì)胞死亡，并且聯(lián)合效果比任一單獨(dú)藥劑顯著高。另外兩個(gè)人癌細(xì)胞系A(chǔ)2780卵巢癌細(xì)胞和PANC-1胰腺腫瘤細(xì)胞，同樣觀察到協(xié)同作用。
　　2、C6神經(jīng)酰胺促進(jìn)長春新堿誘導(dǎo)的凋亡和程序性壞死。使用組蛋白D

9、NA的ELISA測定法和膜聯(lián)蛋白V FACS測定法進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測，結(jié)果表明，長春新堿（1μM）單獨(dú)用藥僅誘導(dǎo)極少的HCT-116細(xì)胞凋亡，而與C6神經(jīng)酰胺(10μg/mL)共用藥顯著增強(qiáng)效果。C6神經(jīng)酰胺對細(xì)胞凋亡的增敏作用幾乎被廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK抑制。通過LDH釋放的增加檢測長春新堿誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞程序性壞死，C6神經(jīng)酰胺的共同用藥處理明顯增加細(xì)胞程序性壞死，而壞死抑制劑necrostatin-1(

10、NEC-1)抑制了聯(lián)合用藥的效果。重要的是，Z-VAD-FMK或NEC-1單獨(dú)可部分抑制C6神經(jīng)酰胺加長春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，但兩者聯(lián)合可幾乎阻斷。需要注意的是NEC-1比Z-VAD-FMK減輕細(xì)胞毒性更有效。類似的結(jié)果在A2780卵巢癌細(xì)胞和PANC-1胰腺癌細(xì)胞中也見到。
　　3、C6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同激活A(yù)MPK依賴性的mTORC1的抑制以及細(xì)胞凋亡和程序性壞死。Western blot的結(jié)果表明，在HCT-116細(xì)胞和

11、A2780細(xì)胞中，C6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同活化AMPK通道，比任一藥物單獨(dú)使用更有效。通過磷酸化S6K1(Thr-389)的檢測反應(yīng)mTORC1活化的，并且對mTORC1依賴性基因，包括Bcl-2和HIF-1α的表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)共同用藥后比單藥mTORC1相關(guān)蛋白水平顯著下調(diào)。類似的結(jié)果在A2780細(xì)胞中也見到。在共同給藥刺激的腫瘤細(xì)胞中，無論是AMPK的激活抑制，還是由基因沉默（shRNA敲低表達(dá)）或通過引入顯性失活(DN)的突變，

12、都可恢復(fù)S6K1磷酸化和Bcl-2/HIF-1α的表達(dá)。重要的是，在HCT-116細(xì)胞中，C6神經(jīng)酰胺加長春新堿引起的細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死都被AMPK沉默或失活突變所抑制。
　　4、C6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同誘導(dǎo)AMPK依賴的p53激活，使其易位到線粒體，與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)相關(guān)蛋白親環(huán)素D(Cyp-D)絡(luò)合形成復(fù)合物。C6神經(jīng)酰胺或長春新堿單獨(dú)誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞中度p53的活化（磷酸化和上調(diào)）。兩者聯(lián)

13、合用藥引起p53的活化進(jìn)一步增加，抑制AMPK（shRNA沉默或基因突變）抑制p53活化。Western blot檢測線粒體蛋白質(zhì)表明C6神經(jīng)酰胺加長春新堿導(dǎo)致p53的轉(zhuǎn)位到線粒體，p53和磷酸化p53兩者都前往線粒體。此外，線粒體-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，p53的易位與Cyp-D的形成復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物被AMPK或Cyp-D的沉默所抑制。另外，Western blot檢測表明通過共同給藥后p53基因易位被AMPK沉默抑制，但不被Cyp-D沉

14、默抑制。反之，AMPK激活A(yù)ICAR誘導(dǎo)p53的激活，導(dǎo)致p53線粒體易位，以及與Cyp-D結(jié)合。通過JC-10染料檢測刺激后HCT-116細(xì)胞中的MMP，結(jié)果表明，C6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同降低MMP，比單獨(dú)給藥更有效。通過相對應(yīng)的shRNA沉默AMPK或Cyp-D抑制聯(lián)合用藥所誘導(dǎo)的MMP減少。
　　5、線粒體蛋白質(zhì)Cyp-D需要的C6神經(jīng)酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥引起壞死，但不是凋亡。Cyp-D抑制劑環(huán)孢菌素A(CSA)以及sh

15、RNA敲低Cyp-D幾乎阻斷聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，而留下的細(xì)胞凋亡不受影響。C6神經(jīng)酰胺加長春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低被Cyp-D-抑制減少。通過的shRNA沉默p53不僅抑制聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的壞死，而且還抑制了細(xì)胞凋亡。
　　6、脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺在體外和體內(nèi)高效增敏長春新堿的活性。根據(jù)以前的操作規(guī)程成功合成了脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺。體外研究結(jié)果表明，該脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺增強(qiáng)長春新堿誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞和A2780細(xì)胞活力降低和凋

16、亡，并且比非脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺具有更高的效率。在體內(nèi)，脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺加長春新堿聯(lián)合對小鼠模型給藥，發(fā)現(xiàn)HCT-116或A2780異種移植生長受到顯著抑制。脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺或長春新堿作為單一給藥，發(fā)現(xiàn)HCT-116或A2780在體內(nèi)生長的只略微受到抑制。IHC檢測結(jié)果表明，在腫瘤異種移植模型中脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥（48小時(shí)）也可誘導(dǎo)顯著AMPK磷酸化/活化，并與非脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺的結(jié)果相一致。小鼠體重也不受

17、上述藥物使用的影響。
　　研究結(jié)論：
　　1、C6神經(jīng)酰胺大幅增敏長春新堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和程序性壞死。
　　2、C6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同激活A(yù)MPK-P53，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和程序性壞死。
　　3、聯(lián)合用藥后AMPK的活化導(dǎo)致mTOR抑制和Bcl-2/HIF-1α的降解。
　　4、聯(lián)合用藥后AMPK依賴性的p53與Cyp-D-線粒體結(jié)合介導(dǎo)程序性壞死。
　　5、在體外和體內(nèi)脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺敏化長春新