紅樹林植物海芒果來源的抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選和作用機(jī)制的研究.pdf

1、肝癌和白血病都是世界上最普遍的惡性腫瘤之一,雖然現(xiàn)在針對(duì)這兩種疾病臨床上采取了手術(shù)、非手術(shù)方式的藥物治療及手術(shù)與藥物治療相結(jié)合的療法,但對(duì)這兩種疾病的治療效果并不完全令人滿意。另外,手術(shù)治療受腫瘤的大小、位置、腫瘤轉(zhuǎn)移等因素的影響,并不是在任何時(shí)候都能實(shí)施。雖然有些西藥也用于治療這兩種疾病,但長期服用會(huì)有較大的毒副作用,因而從天然活性物質(zhì)中尋找并開發(fā)有效低毒的治療藥物變得非常迫切。本課題的目的就是：從紅樹林植物海芒果(Cerbera m

2、anghas L.)來源的化合物中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)理。 方法：利用MTT法研究從海芒果中提取的化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人正常肝細(xì)胞張氏肝(Chang Liver)和人白血病細(xì)胞HL-60增殖的影響；利用吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)雙染的方法從形態(tài)學(xué)上觀察化合物對(duì)細(xì)胞凋亡作用的影響；利用碘化丙啶(PI)單染、Annexin V-FITC和PI雙染后流式細(xì)胞儀分析,及DNA片斷化分析法(DNA f

3、ragment assay)進(jìn)一步證實(shí)化合物是否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用；利用熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)觀察化合物作用細(xì)胞后,對(duì)與細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響；利用Caspase檢測(cè)試劑盒檢測(cè)化合物作用細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞Caspase-3,-8,-9酶活力的影響；運(yùn)用western blot的方法觀察GHSC-79作用后Fas、FasL蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明,海芒果果實(shí)提取的化合物GHSC-71-GHSC

4、-81對(duì)HepG2和HL-60細(xì)胞均有一定程度的抑制作用,其中HepG2細(xì)胞對(duì)化合物GHSC-75最敏感,HL-60細(xì)胞對(duì)化合物GHSC-79最敏感,兩種化合物在25μg/ml的濃度下對(duì)細(xì)胞的抑制率都達(dá)到了98％；進(jìn)一步在化合物GHSC-75對(duì)HepG2細(xì)胞增殖影響的研究中發(fā)現(xiàn),GHSC-75對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性,在作用HepG2細(xì)胞12 h,24 h,48h和72 h后,IC50分別為：192.61±0.19

5、,26.28±0.25,5.79±0.31,1.85±0.13μM,但對(duì)人正常肝細(xì)胞Chang Liver顯示出較低的毒性。流式細(xì)胞分析顯示,化合物GHSC-75作用HepG2細(xì)胞后,細(xì)胞的凋亡作用并不明顯,而HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯在S期和G2/M期。Real-time RT-PCR結(jié)果表明,隨著化合物GHSC-75作用濃度的遞增,周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的基因表達(dá)相應(yīng)增加,而與細(xì)胞周期S期到G2期過渡相關(guān)的周期蛋白激酶C

6、DK2基因表達(dá)呈下降趨勢(shì)；我們又在化合物GHSC-79對(duì)HL-60細(xì)胞影響的研究中發(fā)現(xiàn),GHSC-79對(duì)HL-60細(xì)胞抑制作用也呈濃度和時(shí)間依賴性,當(dāng)濃度低于0.11μM時(shí)GHSC-79對(duì)HL-60細(xì)胞沒有明顯的抑制作用,作用12h,24 h,48 h后,IC50分別為：9.73±0.23,3.40±0.14,2.15±0.16μM。AO/EB染色后,熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核有明顯的核鄒縮,出現(xiàn)凋亡小體等凋亡細(xì)胞形態(tài)。DNA含量和細(xì)胞周期

7、分析結(jié)果顯示,在0,1.15,2.87,5.73,8.60,和11.47μM的GHSC-79作用24 h后,凋亡細(xì)胞率升高呈濃度依賴性,分別為1.74％,1.92％,6.70％,12.38％,17.25％,20.55％,同時(shí)細(xì)胞被阻滯在G2/M和S期。Annexin V-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞儀分析結(jié)果,早期凋亡細(xì)胞率呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性,在0,1.15,2.87,5.73,8.60,和11.47μM GHSC-79作用24 h后

8、早期凋亡細(xì)胞率分別為0.27％,7.52％,12.45％,17.34％,20.49％,21.57％。5.73μM的GHSC-79處理細(xì)胞12 h后與對(duì)照(0.89％)相比,處理組的早期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯升高(9％);處理24 h后與對(duì)照(0.73％)相比,處理組的早期凋亡細(xì)胞數(shù)繼續(xù)上升(14.67％)。DNA片斷化分析結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,GHSC-79處理組作用細(xì)胞48 h后出現(xiàn)明顯的梯形條帶,充分證實(shí)化合物GHSC-79具有誘導(dǎo)HL-6

9、0細(xì)胞凋亡的作用。在Caspase-3,-8,-9酶活力檢測(cè)中,當(dāng)5.73μM GHSC-79處理HL-60細(xì)胞后Caspase-3的活性升高比較明顯,在處理3 h,6 h,12 h和24 h后Caspase-3酶活性分別為對(duì)照組的3.81倍(P<0.05),5.88倍(P<0.05),18.75倍(P<0.01),30.7倍(P<0.01)。Caspase-8,Caspase-9酶的活性在5.73μMGHSC-79處理15 min后就

10、開始升高,分別為對(duì)照的1.7倍(P<0.01)和1.36倍(P<0.05)。雖然Caspase-8,Caspase-9酶的活性隨著處理時(shí)間的增加有所波動(dòng),但與對(duì)照相比,Caspase-8,Caspase-9酶的活性總體都呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)中我們又發(fā)現(xiàn)GHSC-79處理后,能使死亡配體FasL的基因和蛋白水平相應(yīng)增加。 結(jié)論：本課題中,我們從紅樹林植物海芒果果實(shí)中提取的一系列皂苷類化合物(GHSC-71-GHSC-81)對(duì)肝癌細(xì)胞H

11、epG2和白血病細(xì)胞HL-60均有一定程度的抑制作用。其中GHSC-75對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)；GHSC-79對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)；從GHSC-75對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制的研究中發(fā)現(xiàn):GHSC-75通過細(xì)胞周期S期和G2/M期的阻滯,能明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖,并且伴隨著細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p21基因表達(dá)的上調(diào)和S/G2期周期過渡相關(guān)的激酶Cdk2基因表達(dá)的下降。同時(shí)GHSC-75對(duì)正常肝細(xì)胞Chang