Egr-1和WT1優(yōu)勢結(jié)合TGF-β1在白血病細胞分化為單核-巨噬細胞過程中的作用.pdf

1、背景:
　　TGF-β/SMAD信號通路作為一種腫瘤抑制信號，在多種實體瘤中有降低或者異常表達，在白血病中也有異常表達。TGF-β/SMAD信號通路中的組分突變失活或者其下游靶基因的表達失調(diào)可導(dǎo)致TGF-β/SMAD信號通路受阻，白血病細胞異常增殖，分化受阻。大量的證據(jù)表明，TGF-β/SMAD信號通路在TGF-β、維生素D及全反式維甲酸（ATRA）誘導(dǎo)白血病細胞分化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。
　　此外，上游的多種轉(zhuǎn)錄因子也可

2、以調(diào)節(jié)TGF-β/SMAD信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如早期生長反應(yīng)因子1(Early growth response factor1，Egr-1)和Wilms腫瘤基因1(The Wilms' tumour1，WT1))等。另外，有文獻報道，Egr-1和WT1編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)中均含有相似的鋅指結(jié)構(gòu)域，二者具有廣泛的同源性。這些因子編碼的的蛋白與TGF-β1的啟動子區(qū)域有相應(yīng)的結(jié)合位點，通過結(jié)合到靶基因上相應(yīng)的DNA結(jié)合區(qū)域來調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。P21是位于

3、P53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，主要發(fā)揮抑癌的作用。研究表明:P21與腫瘤的分化有密切的關(guān)系。在白血病細胞中，P21處于低表達的水平，可能與其在轉(zhuǎn)錄及翻譯后水平的表達調(diào)控異常有關(guān)。根據(jù)文獻報道，TGF-β可以介導(dǎo)P21的表達。血管內(nèi)皮生長因子VEGF（Vascular endothelial growth factor）作為一種重要的促腫瘤血管生成因子，對造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞可能導(dǎo)致了白血病等惡性血液病的發(fā)生。在體外實驗中

4、，VEGF促進白血病細胞的增殖，抑制其凋亡。根據(jù)文獻中的報道，P21抑癌基因作為TGF-β/SMAD信號通路的靶點之一，與造血干細胞的自我更新有關(guān)，另外SMAD3蛋白可以特異性的結(jié)合到VEGF啟動子區(qū)域(1006-954bp)，從而負向調(diào)控VEGF轉(zhuǎn)錄。P21和VEGF均為TGF-β/SMAD信號通路下游的相關(guān)的靶基因，信號通過的變化必定會引起P21和VEGF的表達變化。
　　在以上背景材料下，我們的實驗以TGF-β/SMAD信號

5、通路為切入點，設(shè)計了相關(guān)的不同的實驗，來研究在不同類型白血病細胞向單核/巨噬細胞分化過程中，Egr-1和WT1對TGF-β1的調(diào)控作用及其對TGF-β/SMAD信號通路信號傳遞的影響。
　　目的:
　　以TGF-β/SMAD信號通路作為研究的切入點，探討佛波酯(PMA)誘導(dǎo)白血病細胞向單核-巨噬細胞方向分化后轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1及其下游轉(zhuǎn)錄因子早期生長反應(yīng)因子-1(Egr-1)和Wilms腫瘤基因1(WT1)的表達變化和

6、TGF-β/SMAD信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)情況，進一步探討Egr-1和WT1是否可以通過調(diào)控TGF-β1來影響TGF-β/SMAD信號通路。
　　方法:
　　建立PMA誘導(dǎo)K562、HL-60、THP-1的白血病細胞分化的體外模型，采用CCK8法檢測不同的PMA的濃度在作用不同時間后對K562細胞的增殖的影響，并計算PMA作用于K562細胞72h后的半數(shù)抑制濃度(IC50)，應(yīng)用Wright-Gimesa染色觀察藥物作用于各白血病細

7、胞之后形態(tài)學(xué)上的變化，運用流式細胞術(shù)檢測細胞分化抗原CD11b、CD14的表達變化，并進行半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Egr-1、WT1及TGF-β/SMAD信號通路中相關(guān)因子如TGF-β1、SMAD3、SMAD4以及信號通路下游基因P21和VEGF在基因水平的相對表達趨勢，同時用Western blot的方法檢測Egr-1、WT1和TGF-β1在蛋白水平的相對表達情況，用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(CHIP)驗證Egr-1

8、、WT1在藥物作用前后與TGF-β1的結(jié)合情況。
　　結(jié)果
　　不同濃度的PMA能抑制K562細胞的增殖并能促進其分化，通過計算得出PMA作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為100 nm/L;在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)的變化，均出現(xiàn)相似的變化，細胞由懸浮狀態(tài)逐漸變?yōu)橘N壁生長，細胞的體積明顯增大，細胞胞質(zhì)的褶皺增多，核質(zhì)比減少，呈現(xiàn)出向成熟的單核-巨噬細胞方向分化的趨勢;細胞表面分化抗原CD11b、CD14的表達量升高;在mR

9、NA水平，TGF-β/SMAD信號通路中TGF-β、 SMAD3、SMAD4的表達呈上升趨勢。在mRNA和蛋白水平，WT1的表達量呈現(xiàn)降低的趨勢，而Egr-1的表達先升高后降低，;信號通路下游基因的靶基因P21的表達量升高，而VEGF的表達量較對照組降低;CHIP實驗說明在正常的白血病細胞中Egr-1與TGF-β1的啟動子區(qū)域之間不結(jié)合，WT1結(jié)合于TGF-β1的啟動子某一區(qū)域;而PMA作用于白血病細胞之后，Egr-1和WT1與TGF-

10、β1啟動子的結(jié)合出現(xiàn)逆反，即藥物作用促使Egr-1結(jié)合于TGF-β1的啟動子區(qū)域，而抑制了WT1與TGF-β1啟動子某一位點的結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　在體外，PMA可以抑制白血病細胞系K562細胞的增殖。PMA作用于各白血病細胞后，細胞呈現(xiàn)出向成熟的單核-巨噬細胞方向分化的趨勢，說明PMA具有較強的誘導(dǎo)K562細胞向單核-巨噬細胞系分化的作用，在此分化過程中，Egr-1可能是通過結(jié)合到TGF-β1的啟動子區(qū)域，從而抑制了WT