Ezrin蛋白在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及黃芩素對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分 Ezrin蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其意義
　　目的:探討Ezrin蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法:1.收集126例骨肉瘤組織石蠟標(biāo)本及27例骨軟骨瘤組織石蠟標(biāo)本，通過免疫組化染色檢測(cè)標(biāo)本中Ezrin蛋白表達(dá)情況;2.分析骨肉瘤組織中Ezrin蛋白表達(dá)與患者性別、年齡以及腫瘤直徑、病理分型、Ennecking分期、位置、肺部轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系。
　　結(jié)果:1.骨肉瘤組

2、織中Ezrin蛋白陽性率(81.74％)明顯高于骨軟骨瘤組織(29.63％)，差異有顯著性(x2=35.63，P＜0.01);2.伴有肺部轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中Ezrin蛋白陽性率(97.78％)較無肺部轉(zhuǎn)移者(72.84％)增加，差異有顯著性(x2=15.68，P＜0.05)，低分化骨肉瘤組織中Ezrin蛋白陽性率(94.87％)也高于中+高分化者(75.86％)（x2=12.32，P＜0.05），但是在不同性別、年齡、腫瘤直徑、Enne

3、cking分期及部位的骨肉瘤組織中Ezrin蛋白陽性率并無顯著性差異(均P＞0.05)。
　　結(jié)論:Ezrin蛋白在骨肉瘤組織中明顯升高，且與腫瘤肺轉(zhuǎn)移及惡性程度相關(guān)。
　　第二部分 Ezrin siRNA對(duì)MG-63細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)Ezrin蛋白在骨肉瘤MG-63細(xì)胞中的表達(dá)，探討Ezrin蛋白在骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法:1.設(shè)計(jì)3對(duì)Ezr

4、in siRNA（Ezrin siRNA1、Ezrin siRNA2、EzrinsiRNA3），轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Ezrin mRNA和蛋白表達(dá)水平，篩選出1對(duì)干預(yù)效果最好的Ezrin siRNA。2.將干預(yù)效果最好的Ezrin siRNA、Scramble siRNA分別轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，并設(shè)立1組未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖;3.通過Transwel

5、l遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移、侵襲能力，細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的黏附能力4.利用Western blotting檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白、Src、磷酸化Src(p-Src)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)表達(dá);5.30只裸鼠隨機(jī)分成3組:空白對(duì)照組(n=10)、Scramble siRNA組(n=10)和Ezrin siRNA組(n=10)，分別通過

6、鼠尾靜脈注射未轉(zhuǎn)染siRNA、轉(zhuǎn)染Scramble siRNA及EzrinsiRNA的MG-63細(xì)胞，第42天處死裸鼠，比較實(shí)驗(yàn)前后體重及肺表面結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)。
　　結(jié)果:1.Ezrin siRNA3對(duì)Ezrin mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用優(yōu)于Ezrin siRNA1、Ezrin siRNA2(P＜0.01)，因此本研究選擇EzrinsiRNA3進(jìn)行后續(xù)研究;2.在24h、48h和72h，Ezrin siRNA組吸光度(OD)值小于空

7、白對(duì)照組、Scramble siRNA組(P＜0.05);3.Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，Ezrin siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對(duì)照組、Scramble siRNA組(P＜0.05)，同時(shí)，Ezrin siRNA組細(xì)胞黏附率較空白對(duì)照組、Scramble siRNA組降低(P＜0.05);4.與空白對(duì)照組、Scramble siRNA組比較，Ezrin siRNA組MMP-2、MMP-9、N-鈣粘蛋白、波形蛋白、p-S

8、rc、p-Akt表達(dá)水平降低(P＜0.01)，而E-鈣粘蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.01)，但Src、Akt表達(dá)水平無變化(P＞0.05);5.Ezrin siRNA組實(shí)驗(yàn)后裸鼠平均體重較空白對(duì)照組、Scramble siRNA組增加(P＜0.05)，但肺表面結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)較空白對(duì)照組、Scramble siRNA組減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.運(yùn)用siRNA下調(diào)Ezrin蛋白表達(dá)可抑制MG-63細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移;2.Ezri

9、n siRNA對(duì)MG-63細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制作用是通過降低MMP-2、MMP-9、N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)、增加E-鈣粘蛋白表達(dá)以及抑制Src、Akt磷酸化實(shí)現(xiàn)的。
　　第三部分黃芩素通過抑制Ezrin表達(dá)和活性抑制MG-63細(xì)胞增殖、侵襲
　　目的:觀察黃芩素對(duì)MG-63細(xì)胞增殖、侵襲及Ezrin表達(dá)、活性的影響，探討黃芩素治療骨肉瘤的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:1.體外培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，利用無水乙醇將黃芩素稀釋成6

10、個(gè)濃度梯度:1、2、4、8、16、32μmol/L，分別處理細(xì)胞24h、48h、72h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，選擇黃芩素干預(yù)48h，計(jì)算黃芩素作用的50％抑制濃度（50％ inhibitory concentration，IC50）;2.隨后以無水乙醇（對(duì)照組）及10、15μmol/L黃芩素處理MG-63細(xì)胞48h，采用Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移、侵襲能力;3.通過細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的黏附能力;4.行熒光實(shí)

11、時(shí)定量PCR、Westernblotting檢測(cè)Ezrin mRNA及Ezrin、磷酸化Ezrin(p-Ezrin)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1.隨著黃芩素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，差異均有顯著性(P＜0.01)，黃芩素干預(yù)48h對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的IC50約為18.35μmol/L;2.Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，10、15μmol/L黃芩素組穿膜細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組(P＜0.05，0.01)，黃

12、芩素15μmol/L組穿膜細(xì)胞數(shù)又低于10μmol/L組（P＜0.05）;3.10、15μmol/L黃芩素組細(xì)胞黏附率較對(duì)照組降低(P＜0.05，0.01)，且黃芩素15μmol/L組細(xì)胞黏附率低于10μmol/L組(P＜0.05)，4.與對(duì)照組比較，10、15μmol/L黃芩素組Ezrin mRNA和Ezrin、p-Ezrin蛋白表達(dá)水平明顯降低，(P＜0.05，0.01)，黃芩素15μmol/L組上述指標(biāo)低于10μmol/L組(P＜